蛋白質(zhì)微膠囊對益生菌包埋的最新研究進展

劉達玉，鄒 強，王 衛(wèi)

(成都大學(xué)，食品加工四川省高校重點實驗室，四川成都 610106)

蛋白質(zhì)微膠囊對益生菌包埋的最新研究進展

劉達玉，鄒 強，王 衛(wèi)*

(成都大學(xué)，食品加工四川省高校重點實驗室，四川成都 610106)

蛋白質(zhì)作為食品體系中的主要成分，具有多種優(yōu)良的理化特性。將其作為益生菌的包埋壁材，不僅可以提高益生菌在不良環(huán)境中的存活率，還可以用于益生菌腸道定位釋放的載體。綜述了蛋白質(zhì)在益生菌包埋方面的應(yīng)用原理及其最新進展。

蛋白質(zhì)，益生菌，包埋

益生菌對外界的不利環(huán)境極易敏感，從下游加工到最終食用過程中有許多因素會影響益生菌的存活率(圖1)。越來越多的增效技術(shù)被用來提高益生菌的耐受性，其中包括預(yù)培養(yǎng)、篩選抗性菌株、添加保護劑和包埋［1］。相比于其它三種方法，益生菌的包埋是最常采用的和最為有效的方法。通過包埋技術(shù)，益生菌細(xì)胞周圍形成一個致密的物理屏障，這將有助于抵御或者延緩空氣、胃酸、膽鹽等有害物質(zhì)的滲透，從而降低不利環(huán)境對細(xì)胞的損害作用。益生菌包埋中最常用的壁材是海藻酸鈉，它的優(yōu)點是:廉價、適用、生物相容性高，另外它具有形成離子型膠體的能力，這種膠體在低酸環(huán)境下很穩(wěn)定，在中性或更高的pH環(huán)境中又能溶解。但是由于海藻酸鈉膠體多孔的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)使得它并不能完全有效地限制小分子有害物質(zhì)的滲透，所以它對益生菌的保護效果也非常有限。另外，海藻酸鈉膠體在有其它螯合劑或者非凝膠型金屬離子存在下會變得不穩(wěn)定［2］。蛋白質(zhì)是一種營養(yǎng)價值很高的天然聚合物，它優(yōu)良的乳化、凝膠、起泡和持水能力使得它成為食品中最重要的組分［3－4］。更重要的是，蛋白質(zhì)許多優(yōu)良的理化性質(zhì)非常適用于益生菌的包埋，并且，以它為壁材的益生菌包埋體系已被越來越多的研究人員所開發(fā)。本文主要綜述了以蛋白質(zhì)為壁材包埋益生菌的原理、方法和強化手段。

圖1 從下游加工到最終食用過程中影響益生菌存活率的主要因素Fig.1 Themain factors affecting survival rate of probiotics

1 蛋白質(zhì)作為益生菌包埋壁材的優(yōu)點

通過酶、酸以及鈣離子的交聯(lián)作用，蛋白質(zhì)能夠在室溫下形成結(jié)構(gòu)致密的凝膠，并且反應(yīng)條件溫和，這將有利于蛋白質(zhì)對那些極易失活的生物活性成分進行包埋。相比于球蛋白分子中帶負(fù)電的基團，帶正電的氨基能產(chǎn)生較強的靜電斥力，因此當(dāng)環(huán)境處于較高pH時，如:pH＞蛋白質(zhì)等電點(p I)，蛋白質(zhì)膠體中的生物活性成分快速釋放;當(dāng)環(huán)境處于較低pH時(pH＜p I)，釋放速度則相對較慢［5］，這就意味著對于那些對酸敏感并需要腸道釋放的生物活性成分來說，蛋白質(zhì)作為包埋壁材是一種不錯的選擇。象乳清蛋白的蛋白質(zhì)，它們具有即親水又親油這樣的天然性質(zhì)，所以它們能夠快速吸附到乳化液滴表面，并通過分子重排和聚集使得乳化液滴表面形成一層連續(xù)且均勻的蛋白質(zhì)膜，這層致密的膜能夠有效地保護分散于乳化液滴內(nèi)的生物活性成分［6－7］。另外，牛乳中的蛋白質(zhì)都具有一定的pH緩沖能力，將牛乳加入到模擬胃液中能夠提高環(huán)境的pH從而增加益生菌在胃酸中的存活率［8－9］。綜上所述，也正是由于蛋白質(zhì)這些優(yōu)良的特性，使得蛋白質(zhì)成為了極具前景的益生菌包埋壁材。

2 以蛋白質(zhì)為壁材的益生菌包埋方法

目前，以蛋白質(zhì)為壁材包埋益生菌的方法主要有三種，它們分別是:噴霧干燥、擠壓和乳化。

2.1 噴霧干燥

雖然噴霧干燥很少用于熱敏性生物活性成分的包埋，但是通過控制工藝條件(進風(fēng)溫度、出風(fēng)溫度和進料速度等)，益生菌細(xì)胞能夠成功地通過噴霧干燥包埋于蛋白質(zhì)基質(zhì)中。用于益生菌噴霧干燥的蛋白質(zhì)壁材主要是牛乳中的蛋白(酪蛋白和乳清蛋白)和明膠。在噴霧干燥過程中，這些蛋白質(zhì)通過穩(wěn)定細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)來保護細(xì)胞免受損傷，并且通過蛋白質(zhì)的成膜特性，使得益生菌細(xì)胞包埋于蛋白質(zhì)微膠囊中［10］。噴霧干燥方法中蛋白質(zhì)的進料類型有兩種:蛋白質(zhì)水溶液和蛋白質(zhì)乳化液(圖2)。對于蛋白質(zhì)水溶液的噴霧干燥，脫脂乳是一種最為合適的蛋白質(zhì)基質(zhì)，這是因為它其中的酪蛋白和小分子乳糖對細(xì)胞壁具有最好的穩(wěn)定作用，另外它較高的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度將有利于提高益生菌在儲藏過程中的穩(wěn)定性［11－13］。但是，在模擬胃液和膽鹽中，脫脂乳對菌的保護效果卻不如明膠好［14］。通過干燥蛋白質(zhì)乳化液，能夠使分散有益生菌的乳化油滴表面覆蓋了一層水不溶性的蛋白質(zhì)膜，在這種蛋白質(zhì)微膠囊中，油相作為一種疏水性物質(zhì)，它能有效抵御氫離子、有機酸、水和氧氣的擴散作用［15－16］;同時，在乳化過程中，蛋白質(zhì)分子將自己的疏水性氨基酸重排于油相，使得這些氨基酸被掩蓋起來，從而不利于胃蛋白酶的水解作用，因為胃蛋白酶水解的特異性位點都是一些疏水性的氨基酸［4，7］。但不足的是，這個包埋方法需要先將微細(xì)化的菌粉均勻地分散于油相中，而菌粉的微細(xì)化既復(fù)雜又費時，并且還會產(chǎn)生對菌有破壞作用的熱量［17］。除此之外，Picot等［18］還發(fā)現(xiàn)相比于噴霧干燥蛋白質(zhì)乳化液，直接噴霧干燥蛋白質(zhì)水溶液對菌的損傷作用較小。

2.2 擠壓

一些球蛋白在熱變性展開之后，通過調(diào)節(jié)pH和離子強度能夠在室溫下形成凝膠?；谶@種原理，可以將熱變性后的球蛋白擠壓到固化液(醋酸鹽緩沖液和氯化鈣溶液)中來實現(xiàn)益生菌的包埋。目前，已有研究采用注射器將分散有益生菌細(xì)胞的乳清蛋白溶液滴入到氯化鈣溶液中來形成蛋白質(zhì)膠球。這膠球不僅能夠在模擬胃腸道中對益生菌提供保護作用，還能提高益生菌在食品加工(加熱和冷凍)和食品儲藏(餅干、果汁、蔬菜汁)過程中的存活率［19－21］。但是蛋白質(zhì)交聯(lián)鈣的能力卻不如海藻酸鈉，所以用于蛋白質(zhì)形成凝膠所需的氯化鈣濃度通常是海藻酸鈉形成凝膠所需濃度的15倍，而高濃度的氯化鈣溶液對益生菌有致死作用。另外，這種方法制備得到的膠球直徑通常都超過3mm，添加到食品中會影響食品的食味品質(zhì)。為了解決上述缺點，Doherty等［22］通過振動式噴嘴將分散有益生菌的乳清蛋白溶液擠壓到醋酸鹽緩沖液中，另一方面為了降低表面張力，吐溫20被加入到醋酸鹽緩沖液中，這種方法制備得到的蛋白質(zhì)微膠囊粒徑可以控制在200μm左右。通過平板技術(shù)和熒光顯微鏡發(fā)現(xiàn)該包埋操作對菌幾乎沒有任何不良影響。并且這些微膠囊在3h的模擬胃液中表現(xiàn)出較高的酸穩(wěn)定性和胃蛋白酶穩(wěn)定性，之后由于高pH和胰蛋白酶的協(xié)同作用導(dǎo)致它們在模擬腸液中快速崩解，從而將包埋的菌全部釋放于模擬腸液中(圖3)。

圖2 益生菌噴霧干燥包埋方法的流程圖Fig.2 Flow diagram ofmicroencapsulation of probiotics by spray－drying

圖3 益生菌擠壓包埋方法的流程圖Fig.3 Flow diagram ofmicroencapsulation of probiotics by extrusion

2.3 乳化

在乳化的包埋方法中，首先要將分散有益生菌細(xì)胞的蛋白質(zhì)溶液加入到大量的植物油中，待形成穩(wěn)定且大小均勻的W/O乳化液之后，才讓蛋白質(zhì)乳化液滴在交聯(lián)劑的作用下形成凝膠顆粒。根據(jù)交聯(lián)劑的類型可將乳化包埋方法分為兩種:內(nèi)源乳化凝膠和外源乳化凝膠(圖4)。前者是在乳化操作之前先將交聯(lián)劑加入到蛋白質(zhì)和菌的懸液中，在形成乳化液之后，蛋白質(zhì)分子在交聯(lián)劑的作用下緩慢地形成凝膠。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶能夠催化蛋白質(zhì)分子發(fā)生酰胺轉(zhuǎn)移反應(yīng)，通過這種反應(yīng)，蛋白質(zhì)分子之間能夠形成共價型的交聯(lián)。Heidebach等［23］開發(fā)了一種以轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶為交聯(lián)劑，通過乳化內(nèi)源凝膠包埋益生菌的方法。如果降低蛋白質(zhì)分子間的靜電斥力，蛋白質(zhì)分子也能相互聚集并形成非共價性的交聯(lián)。凝乳酵素能將伸出酪蛋白膠束表面的κ－酪蛋白從上面切除掉，κ－酪蛋白帶負(fù)電，它的切除有利于降低酪蛋白膠束的負(fù)靜電斥力。因此凝乳酵素也被用作乳化內(nèi)源凝膠系統(tǒng)中包埋益生菌的交聯(lián)劑。在整個過程中，最關(guān)鍵的一步是通過溫度來控制凝膠反應(yīng):在形成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)乳化液之后，快速地將體系的溫度從5℃提升到18℃以上，因為在18℃以下，凝乳酵素不會使酪蛋白溶液凝結(jié)，但當(dāng)溫度提高到18℃以后，凝乳酵素就能重新發(fā)揮作用使酪蛋白乳化液滴轉(zhuǎn)化為膠粒［24］。另外，葡萄酸內(nèi)酯通過緩慢降低蛋白質(zhì)溶液的pH來實現(xiàn)蛋白質(zhì)分子間形成非共價性交聯(lián)。Nag等［25］將這種交聯(lián)劑運用到乳化內(nèi)源凝膠體系中對益生菌進行包埋，但在他們的方法中需要向酪蛋白溶液中加入結(jié)冷膠，因為結(jié)冷膠和酪蛋白能夠產(chǎn)生協(xié)同作用，這種協(xié)同作用主要體現(xiàn)在提高膠體的凝膠強度和膠體對高pH環(huán)境的穩(wěn)定性上。對于乳化外源凝膠方法，辛尼品是一種主要采用的交聯(lián)劑，它能與多個蛋白質(zhì)分子中賴氨酸殘基上的氨發(fā)生非共價性的結(jié)合，從而實現(xiàn)蛋白質(zhì)分子間的交聯(lián);除此之外，它還能夠在形成W/O乳化液之后直接加入到油相促使蛋白質(zhì)乳化液滴從外部開始形成凝膠。Annan等［26］發(fā)現(xiàn)辛尼品含量超過0.01mol/L后，增加辛尼品含量并不能提高明膠微膠囊的粒徑和對菌的保護效果，相反卻能提高微膠囊對模擬胃液的穩(wěn)定性［27］。但是，由于辛尼品的交聯(lián)作用會使蛋白質(zhì)膠囊產(chǎn)生黑藍色的外觀，這將不利于蛋白質(zhì)膠囊添加到食品中。

圖4 益生菌乳化包埋方法的流程圖Fig.4 Flow diagram ofmicroencapsulation of probiotics by emulsification

3 蛋白質(zhì)作為益生菌包埋壁材的缺點

蛋白質(zhì)作為益生菌包埋壁材的缺點主要有兩個:第一，它能被胃蛋白酶水解，使得包埋的益生菌提前釋放于胃液中，從而失去對益生菌的保護作用。Chen等［3］發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)微膠囊在胃液中的降解速度非?？?，在不到1h的時間內(nèi)，幾乎所有的微膠囊都消失了，使得包埋的核黃素全部釋放于模擬胃液中;第二，蛋白質(zhì)膠粒容易相互粘接在一起形成聚集體，這些形狀多變的聚集體在水中很難被分散開。這可能是因為蛋白質(zhì)分子中有一些疏水性的基團，蛋白質(zhì)膠粒通過疏水性聚集來降低這些基團的表面張力，或者是因為水相中存在的鈣和其它金屬離子能夠降低蛋白質(zhì)膠粒之間的靜電斥力，并在它們之間形成鹽橋，這樣就促進了蛋白質(zhì)膠粒的聚集［28－29］。

4 基于蛋白質(zhì)的強化手段

4.1 添加其它輔助物質(zhì)

向明膠微膠囊中加入一些可代謝的糖類能夠提高它們對益生菌的保護效果，例如:麥芽糖。因為在乳化內(nèi)源凝膠過程中，明膠和麥芽糖會發(fā)生相分離，使得在明膠凝膠基質(zhì)內(nèi)形成許多分散有益生菌細(xì)胞的麥芽糖包含體，這樣的結(jié)構(gòu)將有助于延緩酸液滲透進入包含體內(nèi)破壞細(xì)胞;另外，處于包含體內(nèi)的益生菌細(xì)胞能夠更好地接觸碳源，通過代謝這些碳源能夠為益生菌細(xì)胞提供更多的ATP來驅(qū)動F0F1－ATPase將質(zhì)子排除細(xì)胞外［30］。將一些生物廢棄物加入到大豆分離蛋白載體中能夠顯著地延緩L.bulgaricusFTDC在模擬胃液中的釋放并加速它們在模擬腸液中的釋放，這是因為這些生物廢棄物中富含耐酸性的膳食纖維素，益生菌細(xì)胞喜好粘附在這些纖維素上面，所以這些生物廢棄物的添加能夠為益生菌在模擬胃液中提供額外的保護作用;另一方面，生物廢棄物的添加在一定程度上又能破壞大豆蛋白的交聯(lián)程度，從而導(dǎo)致大豆蛋白在模擬胃液中的溶脹率增加［31－32］。有研究［33］表明某些添加物并不是對所有包埋于蛋白質(zhì)載體中的益生菌都有效。半胱氨酸鹽酸鹽是一種氧清除劑和氮源，但是儲藏過程中，它提供給包埋細(xì)胞的作用卻隨著菌株的不同而不同。玉米抗性淀粉會影響蛋白質(zhì)微膠囊的均勻性，從而破壞蛋白質(zhì)基質(zhì)的物理屏障作用，所以玉米抗性淀粉的添加會使得蛋白質(zhì)微膠囊對益生菌保護作用的降低［34］。

4.2 對蛋白質(zhì)載體進行包衣

通過海藻酸鈉的二次包衣能夠有效地減少乳清蛋白基質(zhì)在模擬胃液中的降解;同時還能降低外界溶劑分子對蛋白質(zhì)微膠囊的擴散速度。相比于單純的蛋白質(zhì)微膠囊，經(jīng)過海藻酸鈉包衣的蛋白質(zhì)微膠囊能夠提高酵母在模擬胃液中60%的存活率，并且，在連續(xù)的模擬胃腸道實驗中，經(jīng)過海藻酸鈉包衣的蛋白質(zhì)微膠囊在1h模擬胃液的處理后能夠在1h內(nèi)將所有包埋的酵母細(xì)胞釋放于模擬腸液中［35］。Annan等［36］比較了不同海藻酸鈉包衣方法對益生菌在模擬胃液中的保護效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于內(nèi)源包衣方法，外源包衣方法制備得到的微膠囊表現(xiàn)出更為堅實的特性(更難破碎，在連續(xù)的胃腸道實驗表現(xiàn)出更長的崩解時間)，且提供給菌的保護效果更好。雖然油脂和蠟是兩種能夠抵御水分子滲透的食品級包埋壁材，但是有研究發(fā)現(xiàn)，棕櫚油對蛋白質(zhì)的二次包衣并不能提高菌在儲藏期內(nèi)的存活率，這可能是因為棕櫚油包衣層太薄而在油脂層形成許多裂縫，水分子能夠通過這些裂縫進入蛋白質(zhì)基質(zhì)內(nèi)部來影響菌的儲藏穩(wěn)定性，不過這個問題可以通過向油脂中加入一些塑化劑來解決［37］。

4.3 將蛋白質(zhì)和其它碳水化合物進行反應(yīng)

蛋白質(zhì)可以與多種陰離子多糖產(chǎn)生復(fù)合凝聚。通過控制復(fù)凝聚反應(yīng)環(huán)境的pH、離子強度和聚合物濃度，也能實現(xiàn)對各種生物活性成分的包埋［38］。Oliveria等［39－40］把益生菌分散到酪蛋白和果膠的混合溶液中之后，調(diào)節(jié)pH到4.8，這時果膠和酪蛋白形成不溶性的共聚體，然后再經(jīng)過干燥該體系得到包埋有益生菌的果膠/酪蛋白微粒，該微粒能夠提高益生菌的儲藏穩(wěn)定性，但是提供給益生菌對酸液環(huán)境的保護效果卻隨著干燥方法的不同而發(fā)生變化，由流化床干燥得到的微粒能夠在酸液中有效地保護益生菌，而噴霧干燥得到的微粒則不能。蛋白質(zhì)和還原糖的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物能夠提高益生菌在儲藏期和人體模擬胃腸道中的存活率，這是因為通過美拉德反應(yīng)，蛋白質(zhì)之間可以形成更多的共價交聯(lián)［41－42］，而交聯(lián)程度的提高有助于減少有害物質(zhì)的滲透，同時，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有清除氧和降低氧化還原勢的作用［43］，這將有助于為那些厭氧或微好養(yǎng)的益生菌細(xì)胞提供一個適宜的儲藏環(huán)境。Guerin等［44］向分散有膠囊的NaCl溶液中加入1000μL的0.1mol/L NaOH，由于環(huán)境pH的提升，膠囊內(nèi)部的果膠和乳清蛋白分子通過轉(zhuǎn)酰氨基反應(yīng)而發(fā)生交聯(lián)，從而使得膠囊外部形成一層致密的外殼，這層外殼能夠有效地提高益生菌對低酸和高膽鹽環(huán)境的抗性。

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Review of protein and its application in m icroencapsulation of probiotics

LIU Da－yu，ZOU Qiang，WANG W ei*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology，Chengdu University，Chengdu 610106，China)

Protein was the main ingred ient in food system，which had a lot of excellent physical and chem ical p roperties.Protein could be used in m icroencapsulation of p robiotics，which not only im p rove the survival rate of p robiotic cells in adverse cond itions，but also be used as the vec tor for intestinal delivery of p robiotics.The app lication p rincip le of p rotein in p robiotic m icroencapsulation and its app lication p rogress weremainly reviewed in this manusc rip t.

p roteins;p robiotics;m icroencapsulation

TS201.2

A

1002－0306(2012)12－0409－05

2011－10－18 *通訊聯(lián)系人

劉達玉(1964－)，男，碩士，教授，研究方向:食品科學(xué)與工程。