榆耳菌絲體多糖的體外抗氧化活性研究

王應(yīng)男，張公亮，劉 洋，張 浩，侯紅漫

(大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連 116034)

榆耳菌絲體多糖的體外抗氧化活性研究

王應(yīng)男，張公亮，劉 洋，張 浩，侯紅漫*

(大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連 116034)

利用乙醇分級(jí)沉淀法獲得50%醇沉榆耳多糖、70%醇沉榆耳多糖及85%醇沉榆耳多糖，比較其抗氧化能力。結(jié)果表明:85%醇沉榆耳多糖的還原能力及對(duì)DPPH·的清除作用最強(qiáng)。0.5mg/mL 85%醇沉榆耳多糖對(duì)DPPH·的清除率達(dá)到83.0%，IC50=29.94μg/mL。0.3mg/mL 70%醇沉榆耳多糖對(duì)OH·的清除率達(dá)到84.3%，IC50=0.124mg/mL。榆耳菌絲體多糖清除超氧陰離子效果不理想，清除率僅為8.6%。榆耳菌絲體多糖具有較高的抗氧化活性。

榆耳，多糖，抗氧化

真菌多糖是從真菌中分離得到的由10個(gè)以上的單糖通過糖苷鍵連接而成的高分子聚合物，在國(guó)際上被稱為“生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑”，具有抗腫瘤、抗氧化、防衰老、降血脂、調(diào)節(jié)免疫等多種生物功效［1］。榆耳學(xué)名肉紅膠韌革菌，是一種樹木腐生的珍貴食、藥兼用真菌。近年來研究發(fā)現(xiàn)，榆耳發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)豐富，其中榆耳多糖作為榆耳中主要的活性成分，已受到人們的廣泛關(guān)注［2］。在人體生命活動(dòng)中，自由基是各種生化反應(yīng)的中間代謝產(chǎn)物，化學(xué)活性高。若其不能維持在一定的動(dòng)態(tài)平衡時(shí)，自由基就會(huì)對(duì)機(jī)體造成不同程度的損傷，使機(jī)體加速衰老，嚴(yán)重時(shí)可能誘發(fā)各種疾病。補(bǔ)充含抗氧化劑的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可提高機(jī)體清除自由基的能力［3］。榆耳多糖的抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗炎等多種生物活性已逐漸成為近年來研究熱點(diǎn)［4］，而對(duì)其抗氧化性能的研究報(bào)道較少。本研究選用榆耳菌絲體作為多糖的來源，利用乙醇分級(jí)沉淀法對(duì)不同分子量的榆耳菌絲體多糖組分進(jìn)行抗氧化活性分析，評(píng)價(jià)其還原能力、對(duì)羥基自由基、超氧陰離子、DPPH·自由基的清除能力，尋求榆耳多糖作為天然功能性抗氧化劑的可能，為榆耳的綜合開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

榆耳菌絲體 實(shí)驗(yàn)室搖瓶深層發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)得到榆耳發(fā)酵菌株;無水乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、水楊酸、硫酸亞鐵、30%過氧化氫、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鹽酸、二苯代苦味?；杂苫?DPPH·) 均為分析純。

SC－3610型低速離心機(jī) 科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司;UV2102型紫外分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司;恒溫水浴鍋 鞏義市英峪予華儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 榆耳菌絲體多糖的制備 發(fā)酵菌株→收集菌絲體→冷凍干燥→榆耳菌絲體干粉

按水料比40∶1(V∶W)加入蒸餾水，95℃下熱水浸提8h，4000 r/m in離心15m in。反復(fù)提取三次，收集上清液濃縮至總體積的1/5，加入三倍體積乙醇，4℃靜置過夜，離心，收集沉淀，40℃下烘干。采用Sevag法除蛋白［5］后，對(duì)榆耳菌絲體多糖進(jìn)行乙醇分級(jí)沉淀，使乙醇濃度分別達(dá)到 50%、70%和85%，離心所得沉淀依次為50%醇沉榆耳多糖GI－Ⅰ、70%醇沉榆耳多糖GI－Ⅱ和85%醇沉榆耳多糖GI－Ⅲ。

表1 榆耳菌絲體分級(jí)醇沉多糖還原力測(cè)定結(jié)果Table 1 The reductive ability of polysaccharides from mycelium of Gloeostrereum incarnatum

表2 榆耳菌絲體分級(jí)醇沉多糖對(duì)羥基自由基清除作用結(jié)果Table 2 Hydroxyl free radical scavenging capability of polysaccharides

1.2.2 還原力的測(cè)定 還原力的測(cè)定是用來評(píng)價(jià)抗氧化劑活性的常用方法［6］。取多糖樣品溶液1m L，加入0.1mol/L磷酸緩沖液(pH6.6)0.2m L和1%鐵氰化鉀溶液 1.5m L，混勻，50℃水浴 20m in。迅速加入10%三氯乙酸溶液1m L，靜置5min，4℃下，3000r/min離心10m in。取上清液3m L，加入3m L蒸餾水及0.1%三氯化鐵溶液0.5m L，混勻，于700nm波長(zhǎng)測(cè)吸光值。用蒸餾水代替樣品作無還原能力對(duì)照，VC作為陽性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.3 對(duì)羥基自由基清除作用的測(cè)定 利用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥基自由基可氧化水楊酸，使水楊酸產(chǎn)生有色物質(zhì)，在510nm處有強(qiáng)吸收峰。取多糖樣品溶液 1m L，依次加入 9mmol/L FeSO4溶液 1m L、9mmol/L水楊酸－乙醇溶液1m L、8.8mmol/L H2O2溶液1m L，混勻，37℃水浴放置30min。以蒸餾水代替樣品作空白，VC作為陽性對(duì)照，510nm下測(cè)定吸光值。計(jì)算對(duì)OH·的清除率。

計(jì)算公式:

式中，A1:加入樣品后的吸光度值;A2:樣品本底吸光值;A0:空白吸光值。

1.2.4 對(duì)超氧陰離子清除作用的測(cè)定 利用鄰苯三酚在弱堿性介質(zhì)中會(huì)自身氧化分解產(chǎn)生·及有色中間物檢測(cè)。

鄰苯三酚自氧化曲線的測(cè)定:在兩支具塞試管中分別加入50mmol/L Tris－HCl緩沖液(pH8.2) 4m L、蒸餾水3m L和3mmol/L鄰苯三酚1m L，25℃恒溫水浴20m in，兩支試管中溶液混勻后立即倒入比色皿，于420nm下每隔20s測(cè)定一次吸光值，直到反應(yīng)啟動(dòng)后第500s結(jié)束。加入多糖樣品后鄰苯三酚自氧化曲線的測(cè)定:依上法實(shí)驗(yàn)，以1m L多糖樣品代替1m L蒸餾水，于420nm下測(cè)定加入多糖樣品后的鄰苯三酚自氧化曲線。以VC作為陽性對(duì)照。

計(jì)算公式:

式中，ΔA0:鄰苯三酚的自氧化速率;ΔA:加入多糖樣品后鄰苯三酚的自氧化速率。

1.2.5 對(duì)DPPH自由基清除作用的測(cè)定 二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)，常用來評(píng)估抗氧化物的供氫能力［7］。取多糖樣品溶液 2m L，加入 2m L 0.1mmol/L的DPPH·溶液，迅速混勻后，室溫下避光靜置30m in，在517nm下測(cè)定溶液的吸光值，以70%乙醇溶液代替樣品作為空白，VC作為陽性對(duì)照，計(jì)算其清除率。

計(jì)算公式:

式中，A1:加入樣品后的吸光值;A2:樣品本底吸光值;A0:空白吸光值。

2 結(jié)果與討論

2.1 還原力的測(cè)定

多種抗氧化活性的機(jī)制已經(jīng)被闡明是還原力機(jī)制，鏈引發(fā)的抑制機(jī)制，過渡金屬離子催化劑的折疊機(jī)制，過氧化物的分解和自由基清除機(jī)理［8］。一種化合物的還原能力可以作為潛在的抗氧化活性的一個(gè)重要指標(biāo)。由表1可知，GI－Ⅲ的還原能力最強(qiáng)，且榆耳分級(jí)醇沉所得各組分多糖均具有一定的還原能力，強(qiáng)弱順序?yàn)?GI－Ⅲ＞GI－Ⅱ＞GI－Ⅰ。1mg/m L濃度下GI－Ⅲ吸光值達(dá)到1.909，其還原能力達(dá)到VC的75%，表明榆耳菌絲體多糖中分子量較小組分具有明顯還原能力。如圖1所示，GI－Ⅲ表現(xiàn)出較較強(qiáng)的還原能力，且與VC還原力的變化趨勢(shì)基本相同。濃度在0～0.4mg/m L范圍內(nèi)，吸光值隨濃度的增加顯著增加，當(dāng)濃度大于0.4mg/m L，吸光值變化不大。根據(jù)線性回歸曲線計(jì)算可知，濃度為0.060mg/m L的GI－Ⅲ還原能力與0.044mg/m L VC的體系相當(dāng)。榆耳菌絲體多糖的還原能力說明其能作為一種良好的電子供應(yīng)者，也能終止自由基鏈的反應(yīng)，具有一定的抗氧化能力。

圖1 不同濃度85%醇沉榆耳多糖還原力測(cè)定Fig.1 The reductive ability of GI－Ⅲin different concentration

2.2 羥基自由基清除作用的測(cè)定

由表2可知，榆耳菌絲體分級(jí)醇沉多糖對(duì)羥基自由基均具有良好的清除作用，其中以70%醇沉榆耳多糖 GI－Ⅱ?qū)αu基自由基的清除能力最強(qiáng)。0.3mg/m L濃度下，GI－Ⅱ?qū)αu基自由基的清除率達(dá)到84.3%，GI－Ⅰ對(duì)羥基自由基的清除率達(dá)到73.4%，均高于VC對(duì)羥基自由基的清除率。結(jié)果表明，榆耳菌絲體多糖中具有明顯清除羥基自由基能力的為分子量較大的多糖組分。從圖2中可以看出，GI－Ⅱ的濃度與對(duì)羥基自由基的清除率呈良好的量效關(guān)系，即隨著濃度的增加清除率逐漸升高。當(dāng)濃度小于0.48mg/m L時(shí)，GI－Ⅱ?qū)αu基自由基的清除能力要高于 VC。當(dāng)其濃度達(dá)到 0.48mg/m L時(shí)，GI－Ⅱ與VC對(duì)OH·清除率相當(dāng)。根據(jù)線性回歸曲線計(jì)算得出 VC對(duì)羥基自由基清除作用 IC50= 0.265mg/m L，70%醇沉榆耳多糖IC50=0.124mg/m L?？梢娫诘蜐舛确秶鷥?nèi)，GI－Ⅱ表現(xiàn)出明顯的清除羥基自由基的能力，其結(jié)果明顯高于茶樹菇多糖、靈芝多糖、香菇多糖等多種食用真菌多糖的清除羥基自由基的能力［9－11］，獲得了又一高抗氧化活性多糖。

表3 榆耳菌絲體分級(jí)醇沉多糖對(duì)DPPH·清除作用結(jié)果Table 3 Scavenging activities of polysaccharides from mycelium of Gloeostrereumincarnatum on DPPH·radical

圖2 不同濃度70%醇沉榆耳多糖對(duì)羥基自由基清除作用Fig.2 Hydroxyl free radical scavenging capability of GI－Ⅱin different concentration

2.3 對(duì)超氧陰離子清除作用的測(cè)定

榆耳多糖各醇沉組分均沒有明顯減緩鄰苯三酚的自氧化現(xiàn)象，而VC對(duì)鄰苯三酚的自氧化速率有明顯降低作用，即VC對(duì)超氧陰離子有明顯的清除作用，而榆耳菌絲體多糖對(duì)超氧陰離子的清除作用較弱，清除率最高時(shí)僅達(dá)到8.6%。結(jié)果表明，榆耳多糖幾乎不能與超氧陰離子發(fā)生氧化反應(yīng)達(dá)到清除·的目的。

2.4 對(duì)DPPH·自由基清除作用的測(cè)定

由表 3可知，榆耳菌絲體多糖中，GI－Ⅲ對(duì)DPPH·的清除作用最好。清除能力大小依次為GI－Ⅲ＞GI－Ⅱ＞GI－Ⅰ，與還原能力測(cè)定結(jié)果一致。其中，0.5mg/m L的GI－Ⅲ對(duì) DPPH·的清除率為83.0%，說明榆耳菌絲體多糖對(duì)DPPH·具有較好的清除能力，且分子量較小的組分對(duì)DPPH·的清除作用更強(qiáng)。如圖3所示，當(dāng)VC濃度在0～10μg/m L范圍內(nèi)，對(duì)DPPH·的清除率明顯上升，當(dāng)其濃度大于10μg/m L時(shí)，清除率達(dá)到最大且基本保持不變。GI－Ⅲ濃度在0～80μg/m L范圍時(shí)，對(duì)DPPH·的清除率隨濃度增加明顯上升，當(dāng)其濃度大于80μg/m L時(shí)，其對(duì)DPPH·的清除作用趨于平緩。計(jì)算可以得出，VC的 IC50=2.63μg/m L，85%醇沉榆耳多糖 IC50= 29.94μg/m L。由此可知，當(dāng)85%榆耳醇沉多糖在極低的濃度下，對(duì)DPPH·就具有很強(qiáng)的清除能力。以上結(jié)果說明85%醇沉榆耳多糖對(duì)DPPH·的清除作用明顯。

圖3 不同濃度85%醇沉榆耳多糖對(duì)DPPH·清除作用Fig.3 Scavenging activities of GI－Ⅲin different concentration on DPPH·

3 結(jié)論

本文通過乙醇分級(jí)沉淀獲得分子量不同的榆耳多糖組分GI－Ⅰ、GI－Ⅱ、GI－Ⅲ，比較其抗氧化能力。研究表明，GI－Ⅲ的還原能力和對(duì)DPPH·自由基的清除作用最強(qiáng)，GI－Ⅱ?qū)αu基自由基的清除率最高。且榆耳菌絲體多糖的抗氧化作用在一定濃度范圍內(nèi)，呈現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。除對(duì)超氧陰離子的清除沒有明顯作用以外，與其他真菌多糖相比［12］，榆耳菌絲體多糖表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力，尤其對(duì)羥基自由基的清除能力，以IC50為依據(jù)，更是超過了VC的清除能力。

目前對(duì)于多糖抗氧化活性作用機(jī)理，可能存在如下幾種解釋:a.直接作用于活性氧。b.多糖分子作用于抗氧化酶。c.多糖分子絡(luò)合產(chǎn)生活性氧所必需的金屬離子。

本研究確定了榆耳菌絲體多糖的體外抗氧化能力，但對(duì)于其作用機(jī)理尚不明確，因此，榆耳菌絲體多糖作為一種天然的抗氧化劑，有待于繼續(xù)深入研究其抗氧化機(jī)理、結(jié)構(gòu)與功能的相關(guān)性等，為實(shí)現(xiàn)天然抗氧化產(chǎn)品的開發(fā)研究奠定基礎(chǔ)。

［1］樊錦艷，王秋穎.食藥用真菌多糖的研究與開發(fā)利用［J］.食品工業(yè)科技，2003，24(12):106－107.

［2］宋宏，姚方杰，唐峻，等.榆耳研究概況［J］.中國(guó)食用菌，2008，27(1):3－4.

［3］Volpi N，Tan Igi P.Influence of chondroitin sulfate charge density，sulfate group position and molecular mass on Cu2+mediated oxidation of human low—density lipoprotcins:effect of normal human plasmaderived chondroitin sulfate［J］.J Biochem，1999，125(2):297.

［4］柳洪芳，王新宇，呂金超，等.榆耳多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及抗腫瘤活性研究［J］.中國(guó)生化藥物雜志，2010，31(5): 293－296.

［5］姚毓婧，楊仁智，張勁松，等.雞腿菇子實(shí)體多糖分離純化工藝及結(jié)構(gòu)研究［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2007，34(6):1071－1076.

［6］Qin C G，Huang K X，Xua H B.Protective effect of polysaccharide from the loach on theinvitroandinvivoperoxidative damage of hepatocyte［J］.Journal of Nutritional Biochemistry，2002，13(10):592－593.

［7］Zhang Q B，Yu P Z，Zhou G F，et al.Studies on antioxidant of fucoidan from Lanminaria japonica［J］.Chin Trodit Herb Drugs，2003，34:824－826.

［8］Pellegrini N，Proteggente A，Pannala A，et al.Antioxidant activity applying an improved ABTS+radical cation decolorisation assay［J］.Free Radical Bio Med，1999，26:1231－1237.

［9］王宗君，廖丹葵.茶樹菇多糖抗氧化活性研究［J］.食品研究與開發(fā)，2010，31(1):50－54.

［10］蓋玉紅.靈芝多糖抗氧化活性研究［D］.長(zhǎng)春:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

［11］李芳亮，趙立冬，高楊，等.兩種食用菌多糖提取物的抗氧化活性比較研究［J］.湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011(9):108－111.

［12］苗元振，張紅燕，薛宏偉，等.食藥用真菌多糖抗氧化作用研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2008(增刊):30－33.

Study on antioxidant activities in vitro of polysaccharides from m ycelium ofGloeostrereumincarnatum

WANG Ying－nan，ZHANG Gong－liang，LIU Yang，ZHANG Hao，HOU Hong－man*
(School of Food，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，China)

Using ethanol g rade p recip itation to get three polysaccharides from m ycelium ofGloeostrereum incarnatum.The frac tions were p recip itated w ith 50%alcohol，70%alcohol and 85%alcohol.Com pare their antioxidant capacity.The results showed that the frac tion p recip itated w ith 85%alcohol p rovided the highest ability of reducing capacity and DPPH· rad ical c lear ability.The DPPH· rad ical c lear ability in concentration of 0.5mg/m LGI－Ⅲwas reach up to 83.0%，IC50=29.94μg/m L.At 0.3mg/m L of the fraction GI－Ⅱof p recip itate w ith 70%alcohol，hyd roxyl rad icals－scavenging activities was 84.3%，IC50=0.124mg/m L.The superoxide radicalsscaveng ing ac tivities of polysaccharides fromGloeostrereumincarnatumwere unideal.The scaveng ing rate was only 8.6%.The polysaccharides from m ycelium ofGloeostrereumincarnatumhad d istinc t antioxidant activity.

Gloeostereuminsarnatum;polysaccharides;antioxidation

TS201.2

A

1002－0306(2012)12－0194－04

2011－09－29 *通訊聯(lián)系人

王應(yīng)男(1986－)，女，碩士，研究方向:珍稀食用菌。