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    UPLC-MS/MS檢測(cè)柑桔不同組織中的檸檬苦素

    2012-10-24 09:02:12李新生吳三橋
    食品工業(yè)科技 2012年14期
    關(guān)鍵詞:苦素柑桔檸檬

    江 海,李新生,*,吳三橋,劉 新,韓 豪,高 玥,彭 浩

    (1.陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院,陜西漢中 723000;2.陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西漢中 723000)

    UPLC-MS/MS檢測(cè)柑桔不同組織中的檸檬苦素

    江 海1,2,李新生1,2,*,吳三橋1,劉 新1,韓 豪1,高 玥1,彭 浩1,2

    (1.陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院,陜西漢中 723000;2.陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西漢中 723000)

    目的:檢測(cè)柑桔果皮、果肉、桔絡(luò)以及桔籽中檸檬苦素的含量,分析柑桔加工中苦味物質(zhì)的來源。方法:用UPLC-MS/MS法檢測(cè),色譜柱:waters ACQUITY BEH C18(50mm×2.5mm,1.9μm);流動(dòng)相:A為乙腈,B為純水,采用梯度洗脫:A:10%(0min)-50%(3min)-10%(4min)-10%(5min);流速:0.3mL/min;柱溫:40℃;進(jìn)樣量:5μL;檢測(cè)時(shí)間:5min;正離子模式(ESI+)質(zhì)譜檢測(cè)器:檸檬苦素母離子m/z=471.1,子離子m/z=425.3,m/z=161.1。結(jié)果:在檢測(cè)色譜-質(zhì)譜條件下檸檬苦素檢測(cè)效果良好,柑桔中檸檬苦素含量依次為:桔籽>桔絡(luò)>桔皮>桔肉。結(jié)論:柑桔加工中盡量選用無籽品種,采用手工剝皮,同時(shí)剔除桔絡(luò)能有效地避免產(chǎn)品的苦味。

    UPLC-MS/MS,測(cè)定分析,柑桔,組織,檸檬苦素

    柑桔是世界第一大水果,在全球140個(gè)國家和地區(qū)均有種植,全球柑桔常年總產(chǎn)量為6000~10000萬t,其中柑桔產(chǎn)量居世界前3位的分別為巴西、美國和中國[1-3]。2007年我國柑桔種植面積達(dá)191×104hm2,約占世界柑桔種植總面積的25%,產(chǎn)量達(dá)2059×104t,占世界總產(chǎn)量的17%,我國柑桔種植面積和產(chǎn)量均居世界首位[4]。柑桔是果汁生產(chǎn)的主要原料,柑桔汁產(chǎn)量約占世界果汁總量的67%[5],但我國缺乏柑桔加工優(yōu)勢(shì)企業(yè),柑桔多為鮮食,柑桔加工率不足10%,常有柑桔豐產(chǎn)滯銷現(xiàn)象。柑桔滯銷已成困擾柑桔業(yè)發(fā)展的難題。解決我國柑桔滯銷問題,最可行的辦法就是發(fā)展柑桔深加工。但是,柑桔加工(特別是果汁生產(chǎn))過程中所出現(xiàn)的苦味問題成為制約我國柑桔加工業(yè)發(fā)展的瓶頸。柑桔苦味主要來自檸檬苦素類(Limonins)和柚皮苷類物質(zhì)(Naringin)。檸檬苦素類似物廣泛存在于柑桔屬植物中,其中含量的高低直接影響柑桔的品質(zhì)。柑桔通常鮮食無苦味,但經(jīng)榨汁、殺菌等加工處理后就表現(xiàn)出苦味,這種現(xiàn)象稱之為“延遲苦味”。據(jù)報(bào)道,柑桔汁出現(xiàn)“延遲苦味”的原因主要是在酸性條件和檸檬苦素D環(huán)內(nèi)酯水解酶的催化下,果實(shí)中所存在的非苦味的檸檬苦素A-環(huán)內(nèi)酯轉(zhuǎn)變成了具有強(qiáng)烈苦味的檸檬苦素[6-10]。檸檬苦素含量的高低直接影響柑桔及其產(chǎn)品的品質(zhì),測(cè)定檸檬苦素的含量可用于控制柑桔及其相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量。已報(bào)道的檸檬苦素檢測(cè)方法很多,主要有Davis法、分光光度法、薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)等[11-14],但因檸檬苦素類似物配糖體極性強(qiáng),在提取液中常與許多雜質(zhì)共存,因而對(duì)其檢測(cè)及純化都很困難,多數(shù)檢測(cè)方法效果不佳。這里采用UPLC-MS/MS檢測(cè)了柑桔果皮、果肉、桔絡(luò)以及桔籽不同組織中檸檬苦素的含量,分析柑桔加工中苦味物質(zhì)的來源,旨在為柑桔的深加工提供一些參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    柑桔樣品 2010年11月采于陜西省城固縣郭家山泛亞柑桔種植基地;桔皮樣品 手工剝皮,經(jīng)烘箱60℃烘干、粉粹,過60目分樣篩,備用;桔籽樣品 從桔子中剔除桔籽,烘箱60℃烘干、粉粹,過60目分樣篩,備用;桔絡(luò)樣品 桔瓤外白色的網(wǎng)狀筋絡(luò)通常被稱之桔絡(luò),手工撕下桔絡(luò),烘箱60℃烘干、粉粹,過60目分樣篩,備用;桔肉樣品 將去皮,去籽,剔除桔絡(luò)的柑桔60℃烘干,粉碎,備用;檸檬苦素 純度99.8%,天津一方科技有限公司;乙腈 色譜純,Burdick and Jackson公司;甲醇、石油醚、丙酮 分析純,天津市登峰化學(xué)試劑廠;超純水 娃哈哈廣元純水公司。

    ACQUITY UPLC型超高效液相色譜、ACQUITY TQD型三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀配MassLynxTMMS軟件 美國Waters公司;水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司;SHIMADZU AUW 220D型十萬分之一電子天平、SHIMADZU AUY220型萬分之一電子天平 日本島津公司;SK 1200H型超聲波清洗機(jī) 無錫市興邦基業(yè)電子有限公司;BM 252C型榨汁機(jī) 美的公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 色譜條件 Waters ACQUITY BEH C18(50mm× 2.5mm,1.9μm),柱溫40℃,流速0.3m L/m in,進(jìn)樣5μL。流動(dòng)相為:水:乙腈梯度洗脫,乙腈梯度為10%(0m in)-50%(3m in)-10%(4m in)-10%(5m in)。

    1.2.2 質(zhì)譜條件 毛細(xì)管電壓3.2kV,錐孔電壓40kV,離子源溫度110℃,脫溶劑氣溫度400℃,錐孔氣流量50L/h,脫溶劑氣流量800L/h。離子化模式為大氣壓電噴霧離子源正離子模式(ESI+),碰撞池電壓(collision V)30V,碰撞氬氣流速0.14m L/m in。采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM),檸檬苦素母離子m/z=471.1,子離子m/z=425.3、m/z=161.1。

    1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱取檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品2.85mg,用10m L乙腈溶解,超純水定容至25.0m L。制得檸檬苦素114mg/L的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照母液。

    1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 取檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)母液0.05、0.1、0.5、1.0、2.0m L,用50%的乙腈水溶液定容于10m L容量瓶。得到檸檬苦素0.57、1.14、5.70、11.40、22.80mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。在儀器設(shè)定的色譜-質(zhì)譜條件下,通過0.22μm濾膜過濾,進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)梯度樣品各5μL,以檸檬苦素母離子m/z=471.1進(jìn)行選擇,m/z=425.3為定性離子,m/z=161.1為定量離子。

    1.2.5 定量限實(shí)驗(yàn) 將檸檬苦素0.57μg/m L的標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋,在液相質(zhì)譜分析條件下進(jìn)樣分析,以S/N=10,確定檸檬苦素的定量限。

    1.2.6 樣品溶液制備 稱取干燥的桔皮、桔籽、桔絡(luò)、桔肉各3.0g于250m L的圓底燒瓶中,量取50.0m L石油醚(30~60℃)于40℃超聲脫脂30min,抽濾,棄去濾液;向?yàn)V渣中加入50.0m L丙酮,40°C超聲提取30m in,過濾;濾液揮干,用50%乙腈-水(V∶V)溶液定容至50.0m L。過0.22μm有機(jī)微孔濾膜后在設(shè)定的液相-質(zhì)譜條件下檢測(cè)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 線性范圍

    標(biāo)樣色譜圖見圖1。以濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,檸檬苦素線性回歸方程為:Y=62.7883X+11.245,r=0.99954。該檢測(cè)條件下,檸檬苦素在2.85~114ng之間線性關(guān)系良好。

    圖1 檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品色譜-質(zhì)譜圖Fig.1 The limonin’s chromatogram of standard

    2.2 定量限確定

    經(jīng)實(shí)驗(yàn),在液相-質(zhì)譜分析條件下進(jìn)樣分析得到S/N=10,計(jì)算得檸檬苦素的定量檢測(cè)限為2.8ng/m L。

    2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    取桔籽樣品,按1.2.6方法制備樣品,在色譜-質(zhì)譜條件下平行測(cè)定5次,每次進(jìn)樣5μL,測(cè)定檸檬苦素的峰面積,計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。其中檸檬苦素的峰面積分別為850.2、845.6、878.3、866.7、835.5,RSD=2.00%(n=5),結(jié)果表明方法的重復(fù)性良好。

    2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    取桔籽樣品,按1.2.6方法制備,在色譜-質(zhì)譜條件下,分別在0.5、1、6、12、24h進(jìn)樣5μL檢測(cè)檸檬苦素的峰面積,分別為866.4、895.3、875.8、832.9、885.3,計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,求得RSD為2.75%(n=5)。結(jié)果表明在該方法條件下,檸檬苦素穩(wěn)定。

    2.5 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    精密量取已測(cè)定檸檬苦素為218.49mg/kg的桔肉3.0g,加入5.70mg檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),按1.2.6方法制備樣品條件平行制備3份,在色譜-質(zhì)譜條件下測(cè)定,計(jì)算檸檬苦素的回收率,結(jié)果如表1所示。

    表1 回收率測(cè)定結(jié)果Table 1 Themeasurement results of recovery

    從表1可知,檸檬苦素的平均回收率為99.53%,RSD=2.91%(n=3)。同樣的方法計(jì)算桔籽的平均回收率為99.32%,RSD=2.15%(n=3);桔絡(luò)的平均回收率為101.54,RSD=2.54%(n=3);桔皮的平均回收率為100.85%;RSD=3.14%(n=3)。結(jié)果表明方法準(zhǔn)確可靠。

    2.6 柑桔中不同組織檸檬苦素質(zhì)量濃度的測(cè)定結(jié)果

    依樣品制備方法和測(cè)定條件,對(duì)桔籽、桔絡(luò)、桔肉、桔皮樣品中的檸檬苦素質(zhì)量濃度測(cè)定,色譜-質(zhì)譜圖見圖2,結(jié)果見表2。

    圖2 桔籽中檸檬苦素色譜-質(zhì)譜圖Fig.2 The limonin’s chromatogram of citrus seeds

    表2 樣品測(cè)定結(jié)果(n=3)Table 2 Themeasurement results of samples

    柑桔中各個(gè)部分均含有檸檬苦素,其中桔籽、桔絡(luò)中檸檬苦素含量較高,桔肉中含量最低。柑桔的含水率在95%左右,將桔肉中檸檬苦素含量換算為柑桔汁中的檸檬苦素含量大概為10mg/kg左右,與直接利用桔子汁進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果基本相吻合。

    3 結(jié)論與討論

    在實(shí)驗(yàn)分析過程中,就實(shí)驗(yàn)樣品的處理進(jìn)行了多次實(shí)驗(yàn)。檸檬苦素在桔肉中含量較低,為了與桔籽、桔絡(luò)、桔皮檢測(cè)干燥樣品相比較,我們采用將桔肉烘干的辦法。但桔肉檢測(cè)的最終結(jié)果通過含水率換算后,比直接采用桔汁檢測(cè)大15%左右,這可能與桔子汁的后苦效應(yīng)有關(guān),同時(shí)也與桔肉樣品處理步驟增多,增加結(jié)果檢測(cè)誤差有關(guān)。如要測(cè)定桔汁的檸檬苦素含量,最好直接采用桔汁提取后檢測(cè)。在色譜條件的選擇上曾使用HPLC結(jié)合VWD(紫外-可見吸收)檢測(cè),因檢測(cè)波長(zhǎng)在203nm,分析基線噪音很大,結(jié)果不理想,同時(shí)HPLC分析時(shí)間較長(zhǎng)。采用UPLC后,分離效率明顯提高;采用DAD(二極管陣列)檢測(cè),檢測(cè)效果較VWD好,但檢出限較高,重復(fù)性較差,對(duì)低含量檸檬苦素?zé)o法檢測(cè)。采用UPLC-MS/MS分析,分離效果好,檢出限低,實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性、穩(wěn)定性良好,為實(shí)驗(yàn)所選擇。柑桔中的檸檬苦素主要存在于桔籽和桔絡(luò)中,柑桔皮除含有檸檬苦素,還含有柚皮苷類致苦物質(zhì),在桔汁加工中清除桔皮,桔籽和桔絡(luò)能有效避免苦味物質(zhì)的產(chǎn)生。但在實(shí)際工業(yè)加工中,桔子去皮可通過工藝改進(jìn)實(shí)現(xiàn),去籽和去桔絡(luò)則難度太大,暫無有效方法。鑒于此,建議桔汁加工原料盡量選用無籽和桔絡(luò)較少的柑桔品種。為利于柑桔加工,柑桔種植基地可進(jìn)行無籽、少桔絡(luò)柑桔品種的育種和推廣。

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    Detection of limonin in citrus with different tissue by UPLC-MS/MS

    JIANG Hai1,2,LIXin-sheng1,2,*,WU San-qiao1,LIU Xin1,HAN Hao1,GAO Yue1,PENG Hao1,2
    (1.School of Biological Science&Engineering,ShaanxiUniversity of Technology,Hanzhong 723000,China;2.Shaanxi Key Laboratory of Resource Biology,Hanzhong 723000,China)

    Ob jec tive:Determ ined the contents of Limonin in citrus peel,citrus flesh,d ried tangerine fibre and citrus seed.Analysis of the source of citrus bitterness substances in p rocessing.Methods:The column was waters ACQUITY BEH C18(50mm×2.5mm,1.9μm)by UPLC-MS/MS,mobile phase:using g rad ient elution,A was acetonitrile and B was water,A:10%(0m in)-50%(3m in)-10%(4m in)-10%(5m in),the velocity of flow was 0.3m L/m in,column temperature was 40℃,injection quantity was 5μL,detection time was 5m in,ESI(+)scan,the limonin’s parents were m/z=471.1,daughter were m/z=425.3 and m/z=161.1.Results:Limonin could be detected in the chromatog raphy-mass spectrum cond itions.The limonin contents discretion order in citrus was citrus seed>d ried tangerine fibre>citrus peel>citrus flesh.Conc lusion:In citrus p rocessing,tried to choose seed less varieties.Using manualskinning,and elim inate d ried tangerine fibre could avoid the bitter.

    UPLC-MS/MS;determ ination;c trus;tissue;limonin

    TS255.1

    A

    1002-0306(2012)14-0087-03

    2011-12-13 *通訊聯(lián)系人

    江海(1977-),男,碩士,實(shí)驗(yàn)師,研究方向:生物資源開發(fā)利用。

    陜西省教育廳科研項(xiàng)目(2011GJ21,11JS033);陜西理工學(xué)院科研資助項(xiàng)目(SLG0814)。

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