豬細(xì)小病毒4型在試驗(yàn)豬的感染進(jìn)程及在組織中的分布研究

黃 律，龍進(jìn)學(xué)，張宏彪，袁世山，，徐大為，劉婷婷

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所,上海 200241;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，南京 21009; 3.勃林格殷格翰動(dòng)物保健,北京 100004）

豬細(xì)小病毒4型是2009年由美國(guó)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)的一種新型細(xì)小病毒，根據(jù)基因組分析目前暫將其歸入細(xì)小病毒科，細(xì)小病毒亞科，博卡病毒屬[1]。博卡病毒屬最早由牛細(xì)小病毒（BPV）和犬微小病毒（CMV）組成。因?yàn)橐话慵?xì)小病毒都只有2個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORFs），而B(niǎo)PV和CMV具有第3個(gè)開(kāi)放閱讀框，所以將其單獨(dú)歸入新的屬，并取宿主牛和犬的英文單詞前2個(gè)字母組成BoCa（博卡）病毒的名稱。PPV4與BoCa病毒一樣具有3個(gè)ORFs[1-2]。

近2年來(lái)，許多型的豬博卡病毒被不斷發(fā)現(xiàn)[3-6]，關(guān)于PPV4乃至其他型豬博卡病毒的研究目前還都僅停留在流行病學(xué)調(diào)查和序列分析。人博卡病毒最早于2005 年被發(fā)現(xiàn)，目前已經(jīng)分離到病毒，但還尚未確定其致病性[7]。從目前人博卡病毒的臨床病例分析來(lái)看，成人博卡病毒IgG的陽(yáng)性率高達(dá)94.2%；人博卡病毒主要感染8歲以下兒童，特別是嬰兒；人博卡病毒陽(yáng)性患兒絕大多數(shù)都存在呼吸道以及腸道疾病[8-12]。應(yīng)用熒光定量PCR對(duì)人博卡病毒進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)人博卡病毒存在于人體多種器官，糞便、呼吸道樣本以及血清中檢出率較高，而定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)通常在血清中博卡病毒含量較高[13-17]。

本研究基于本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立優(yōu)化的Taqman熒光定量PCR技術(shù)[18]，對(duì)試驗(yàn)豬攻毒PPV4陽(yáng)性血清，初步了解攻毒后試驗(yàn)豬的癥狀、血清中病毒DNA拷貝數(shù)的變化、各器官病理變化及病毒含量，并且嘗試運(yùn)用陽(yáng)性血清富集PPV4病毒粒子。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)豬與陽(yáng)性病料

試驗(yàn)豬為35日齡未閹割長(zhǎng)白斷奶仔豬，經(jīng)嚴(yán)格挑選，選取體重與健康狀況一致，PPV4為陰性的試驗(yàn)豬6頭。用于動(dòng)物試驗(yàn)的PPV4陽(yáng)性病料JS0910，JS0909，JS0918均由本實(shí)驗(yàn)室收集、鑒定和保存。試驗(yàn)豬和陽(yáng)性病料在實(shí)驗(yàn)前均確保豬繁殖與呼吸綜合征病毒、圓環(huán)病毒、豬瘟病毒、豬細(xì)小病毒、偽狂犬病毒均為陰性。

1.2 儀器和試劑

主要儀器有Realplex4熒光定量PCR儀（Eppendorf），病料自動(dòng)研磨器（拓夫機(jī)電科技）。DNA提取試劑盒（TIANGENE公司，DP315），熒光定量PCR2×HSTaqMIX（上海睿安生物技術(shù)公司），日立HP-900電子顯微鏡。

1.3 引物和探針的設(shè)計(jì)合成

根據(jù)GenBank 上公布的PPV4全基因組序列（GQ387500、GQ387499）以及本實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增的國(guó)內(nèi)PPV4全基因組序列（GU978964-GU978968,HM031134.1-HM031135.1），選取VP基因中的特異性保守序列設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針，上游引物：5'-TGGTGGTCAAGTATCTGTGCC-3'，下游引物：5'-TTGCTTTTG GATGTCC-TGGT-3'，探針序列：5'-Fam-CCAAACAGCGGC TTCGTGC-Tamara-3'。引物和探針均由上海睿安生物技術(shù)公司合成。

1.4 病毒DNA的提取

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后解剖試驗(yàn)豬，無(wú)菌收集臟器，稱重，按1∶1(mL∶ mg)加入PBS進(jìn)行研磨。組織樣品研磨液與血清樣品反復(fù)凍融3次后，12 000 r/min離心，吸取上清液用于病毒核酸的提取，采用天根公司的病毒DNA提取試劑盒。

1.5 Taqman 熒光定量 PCR 反應(yīng)

Taqman 熒光定量PCR反應(yīng)參考本實(shí)驗(yàn)室已建立的檢測(cè)方法[18]進(jìn)行：Realtime-PCR 總體系為 25μL，其中2×HS Taq 12.5μL，上、游引物(10 μM)各0.5μL，探針(10μM)0.5μL，模板2μL，余下用滅菌ddH2O 補(bǔ)足。反應(yīng)條件為95 ℃ 2 min，95 ℃ 10 S，60 ℃ 40 S并采集熒光強(qiáng)度，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

Taqman 熒光定量PCR擴(kuò)增曲線：y =-3.478x + 41.26，R2=0.998，擴(kuò)增效率：0.94。

1.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

選擇35日齡的未閹割的長(zhǎng)白小豬6頭，分3組進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。每組都有一公一母2頭試驗(yàn)豬，2組接毒，1組作為陰性對(duì)照。重復(fù)本實(shí)驗(yàn)2次。

選取PPV4陽(yáng)性病料（血清）（DNA拷貝數(shù)約 105/μL）JS0910，JS0909，JS0918各10 mL，混合后12 000 r/min離心15 min取上清，過(guò)0.22μm的濾器以除去細(xì)菌雜質(zhì)。接種病料制備好后立即接種實(shí)驗(yàn)豬：接種方式為頸部肌肉多點(diǎn)注射，每只試驗(yàn)豬注射PPV4陽(yáng)性血清5 mL。此后每日觀察試驗(yàn)豬的運(yùn)動(dòng)、呼吸、采食和飲水，每4天采血一次并測(cè)量體溫（直腸）。在試驗(yàn)豬血清PPV4陽(yáng)轉(zhuǎn)開(kāi)始，分別在攻毒后第8、16、24天和30天分別處死1頭豬。收集每只試驗(yàn)豬的血清；之后將試驗(yàn)豬進(jìn)行剖解，觀察各臟器的病理變化，無(wú)菌收集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、扁桃體、子宮、睪丸、腹部淋巴結(jié)、胃、大腸、小腸、氣管、腦等組織器官以及肺部灌洗液。按照1∶1（mL∶mg）加入無(wú)菌PBS將上述病料進(jìn)行研磨，取上清，提取DNA后進(jìn)行Real-timePCR檢測(cè)，換算出每毫克實(shí)驗(yàn)豬各組織中病毒的拷貝數(shù)。

1.7 PPV4病毒粒子觀察

剖殺PPV4陽(yáng)性豬時(shí)，用大燒杯收集盡可能多的豬血，隨后立即使用50 mL離心管5 000 r/min離心10 min，吸取上清-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取PPV4陽(yáng)性血清150 mL置于離心管中，平衡后4 ℃ 9 000 g離心30 min，取出離心管肉眼可見(jiàn)離心管底部明顯的白色沉淀。小心倒出上清，置于離心管中平衡后4 ℃9 000 g離心30 min，此時(shí)離心管底部已經(jīng)很難看見(jiàn)明顯的白色沉淀。吸取上清進(jìn)行超速離心：將上清置于3個(gè)超離專用離心管中，每個(gè)約可加38 mL，將液體加滿至離心管的上沿約2～3 mm，小心蓋上離心管蓋子，放入離心機(jī)確認(rèn)無(wú)誤后關(guān)閉離心機(jī)艙蓋，等待溫度降至4 ℃及抽真空完成后160 000 g離心3 h。3 h后肉眼可見(jiàn)離心管底部有少量的沉淀，病毒顆粒在此沉淀中。棄去上清，將3管離心管中的沉淀每管用13 mL的STE緩沖液進(jìn)行小心吹打，使其徹底溶于緩沖液中，3管合并為1管。配置25%的蔗糖溶液5 mL加于一只新的離心管底，將含病毒粒子的緩沖液小心翼翼加到蔗糖上部，加的時(shí)候不可破壞蔗糖溶液，加完液體之后保持蔗糖溶液和緩沖液的分層。將離心管加滿至離離心管的上沿約2～3 mm，如首次超離，超離160 000 g 2 h，小心取出離心管，棄去上清，將病毒粒子用1 mLSTE緩沖液懸浮，用電鏡放大2 000倍后觀察。

2 結(jié)果

2.1 試驗(yàn)豬攻毒后的臨床變化及剖解病變

試驗(yàn)豬攻毒PPV4后未出現(xiàn)死亡，但攻毒豬相對(duì)于陰性對(duì)照豬生長(zhǎng)速度明顯減緩，被毛粗亂。攻毒豬攻毒1 d后即出現(xiàn)大量流涕，咳嗽以及大聲喘氣等癥狀，攻毒14 d后咳嗽和喘氣癥狀逐漸好轉(zhuǎn)，20 d后流涕癥狀也逐漸消除。采食、飲水和排泄均正常。測(cè)量體溫發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)豬在攻毒后的第4天體溫略升高1～2 ℃，此后趨于正常。

對(duì)死亡豬進(jìn)行剖解發(fā)現(xiàn)大部分豬全身淋巴結(jié)腫大，特別是腸系膜淋巴結(jié)腫大明顯（見(jiàn)圖1）部分肺臟呈現(xiàn)淤血（見(jiàn)圖2），有一頭豬還出現(xiàn)肝臟周邊組織梗死，其他臟器均未見(jiàn)明顯肉眼病變。

圖1 腸系膜淋巴結(jié)腫大

圖2 肺臟部分淤血

2.2 TaqMan熒光PCR對(duì)試驗(yàn)豬組織中病毒的檢測(cè)

對(duì)試驗(yàn)豬攻毒的30 d內(nèi)試驗(yàn)豬體內(nèi)PPV4 DNA的拷貝數(shù)呈明顯的消長(zhǎng)曲線，大約在接毒后8 d左右病毒的含量達(dá)到最高峰，拷貝數(shù)約為107/μL，隨后病毒的含量逐漸開(kāi)始下降，到接毒30 d后病毒含量已經(jīng)下降到104左右（見(jiàn)圖3）。陰性對(duì)照豬均未檢測(cè)到PPV4 DNA。

對(duì)試驗(yàn)豬進(jìn)行剖解，收集器官進(jìn)行組織嗜性研究發(fā)現(xiàn)病毒在各個(gè)器官均有分布，含量相差在100倍以內(nèi)，說(shuō)明PPV4可能存在于多種器官。不同時(shí)間處死的PPV4陽(yáng)性豬各器官中PPV4 DNA拷貝數(shù)也略有不同，相差在10倍以內(nèi)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)前期病毒含量在扁桃體以及肺臟含量較高，后期在腸道、胃部以及泌尿道的含量開(kāi)始上升，最終腸道和泌尿器官部分的病毒含量最高（見(jiàn)圖4）。陰性對(duì)照豬各器官均未檢測(cè)到PPV4 DNA。

2.3 PPV4 病毒粒子電鏡觀察

用電子顯微鏡20 000倍觀察,觀察視野中可見(jiàn)一些類似于細(xì)小病毒大小的顆粒，大小約20～30 nm。（見(jiàn)圖5）

3 討論

近幾年豬場(chǎng)斷奶前仔豬頻發(fā)頑固性腹瀉，特別是2011年春季，由于腹瀉導(dǎo)致了大量仔豬的死亡。一些研究報(bào)道認(rèn)為這可能與豬博卡病毒感染有關(guān)，從本實(shí)驗(yàn)來(lái)看豬博卡病毒可能并非其元兇。PPV4感染的試驗(yàn)豬在前期主要表現(xiàn)為呼吸道癥狀：例如流涕、咳嗽，但在感染2周后這些癥狀消失，PPV4陽(yáng)性豬生長(zhǎng)速度明顯慢于陰性豬，未見(jiàn)類似于人博卡病毒感染所致的腸道癥狀[8-17]；PPV4陽(yáng)性豬的飲水、采食以及運(yùn)動(dòng)均正常。說(shuō)明PPV4的致病性可能并非致死性，主要影響豬的生產(chǎn)性能。

對(duì)試驗(yàn)豬注射PPV4陽(yáng)性血清后可產(chǎn)生病毒血癥，血清中病毒DNA含量呈現(xiàn)明顯的消長(zhǎng)曲線，病料接種試驗(yàn)豬8 d后體內(nèi)的PPV4DNA含量達(dá)到高峰。同欄舍的實(shí)驗(yàn)豬在8 d后能夠感染PPV4說(shuō)明PPV4也具有傳染性，并且傳染速度較快，從飼養(yǎng)情況來(lái)看很可能通過(guò)接觸傳播以及糞口傳播，這一點(diǎn)與人博卡病毒現(xiàn)有的傳播途徑的推測(cè)一致[8-12]。

從試驗(yàn)豬各器官的病理變化來(lái)看，主要病變?yōu)榉闻K淤血以及全身淋巴結(jié)腫大，特別是腸系膜淋巴結(jié)。當(dāng)然從實(shí)驗(yàn)的條件來(lái)看，這也不能斷定就一定是由PPV4引起。從試驗(yàn)豬的各組織器官的病毒DNA含量來(lái)看，病毒可能首先攻擊試驗(yàn)豬的呼吸器官和免疫器官：肺臟和扁桃體，隨后攻擊腸道以及泌尿器官。這一點(diǎn)與試驗(yàn)豬前期的呼吸道癥狀吻合，病毒最后對(duì)試驗(yàn)豬的腸道以及泌尿道器官的侵害可能也并不是非常強(qiáng)烈，因?yàn)樵囼?yàn)豬并未出現(xiàn)腸道癥狀，這可能使得PPV4病毒可以通過(guò)腸道以及泌尿道不斷向外排毒，導(dǎo)致了其他豬的感染。

本次試驗(yàn)的結(jié)果也只是對(duì)PPV4的初步研究和探討，欲知道其確切的致病機(jī)理和危害等還需更為科學(xué)嚴(yán)格的動(dòng)物試驗(yàn)，及分離到PPV4,以及采用SPF豬進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)等。

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