綜述鹽酸克倫特羅的檢測方法

韓春曉，張 勇

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，沈陽 110866）

“瘦肉精”是一類違禁藥物的總稱，這類藥物實(shí)際上既不是獸藥，也不是飼料添加劑，而是我國禁止應(yīng)用的非法添加物。其實(shí)質(zhì)是腎上腺類神經(jīng)興奮劑，主要有鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、硫酸沙丁胺醇、硫酸特布他林、西巴特羅及鹽酸多巴胺等7種。現(xiàn)在不法分子添加于畜禽日糧的瘦肉精，是鹽酸克倫特羅。鹽酸克倫特羅最早作為止喘藥用于防治哮喘和支氣管痙攣。在20世紀(jì)70年代末，美國等發(fā)達(dá)國家開始了將鹽酸克倫特羅用作“營養(yǎng)重分配劑”及“促生長劑”的試驗(yàn)性研究，發(fā)現(xiàn)其能夠提高胴體瘦肉率，曾被廣泛使用[1]。20世紀(jì)80年代的時候，我國浙江大學(xué)的專家對其進(jìn)行研究，并應(yīng)用于畜禽飼料中。此后，由于食用飼喂了瘦肉精的畜禽（及其制品）及內(nèi)臟后出現(xiàn)了食物中毒事件，而被國家明令禁止添加使用[2]。

我國明令禁止在生豬養(yǎng)殖中添加“瘦肉精”。因此，檢測顯得尤為重要。以建立一個完整的動物性食品檢測系統(tǒng)，保障人們的健康和安全。筆者就鹽酸克倫特羅的檢測方法作一綜述。

1 感官檢測

豬屠宰后，可以從肉的顏色和品質(zhì)上來判斷是否含有鹽酸克倫特羅，如果肉色澤鮮紅，松軟，后臀肌飽滿突出，脂肪層非常薄，胴體兩側(cè)腹股溝脂肪層內(nèi)毛細(xì)血管分布密集，甚至充血，就可懷疑這樣的豬肉里含有鹽酸克倫特羅[3]。

2 色譜檢測

2.1 高效液相色譜法

高效液相色譜法（HPLC）具有檢測精確度高、假陽性率低的特點(diǎn)，檢測鹽酸克倫特羅殘留的最低檢測限為1～15 μg/kg，國內(nèi)已將高效液相色譜法作為檢測鹽酸克倫特羅殘留的半確證性方法。

趙榕等（2000）運(yùn)用反相高效液相色譜法測定豬肝中的鹽酸克倫特羅，在243 nm的檢測波長下，用waters-alliance高效液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行檢測，流動相為甲醇和磷酸二氫鈉水溶液（35+65），最后再根據(jù)保留時間RT值初步定性，掃描光譜進(jìn)一步確證，根據(jù)試樣峰高或峰面積與標(biāo)準(zhǔn)峰高或峰面積比較進(jìn)行定量。當(dāng)試樣取樣量為2.0 g時，該法的最低檢出濃度為0.25 mg/kg[4]。苗虹等（2001）將樣品勻漿后用鹽酸溶液超聲加熱提取，再用異丙醇:乙酸乙醋（40∶60）萃取，有機(jī)相濃縮后，用弱陽離子交換柱進(jìn)行分離用乙醉-氨（98∶2）溶液洗脫，洗脫液以流動相（甲醇和0.01 mol/L KCl溶液以45∶55的比例配合）定容后，用美國Agilent1100高效液相色譜儀系列進(jìn)行檢測，檢測限達(dá)0.5 μg/kg[5]。蔡玉枝等（2002）運(yùn)用高效液相色譜法測定豬組織中鹽酸克倫特羅殘留量，采用了Dianon sil C18 200×4.6 mm的色譜柱，流動相為0.01 mol/L NaH2PO4：甲醇（67∶33），二極管陣列檢測器，檢測波長為243 nm。采用外標(biāo)法，以保留時間定性，并以鹽酸克倫特羅的特征紫外吸收光譜對照樣品的掃描光譜進(jìn)行確認(rèn)，然后根據(jù)樣品峰面積計(jì)算鹽酸克倫特羅含量[6]。還有人先用C18二氧化硅硅膠柱凈化，用HPLC分離，再結(jié)合HPLC/ELISA檢測、確證[7-9]。高效液相色譜的缺點(diǎn)是檢測過程煩瑣、檢測時間長, 需貴重儀器、難于操作、價格昂貴。

2.2 氣象色譜-質(zhì)譜法

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC/MS）可以在多種殘留物同時存在的情況下對某種特定的殘留物進(jìn)行定性定量分析，且具有較高的靈敏度，是檢測鹽酸克倫特羅殘留的常用的方法之一。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法可用于飼料、血液、組織中鹽酸克倫特羅的分析，檢測限為0.5 μg/kg。與高效液相色譜法相比，檢測靈敏度更高，假陽性率更低。因此，中國、歐盟及美國等國家將氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法定為檢測鹽酸克倫特羅的確證性方法。

吳銀良等（2006）建立了同時測定動物肝組織中鹽酸克倫特羅和鹽酸萊克多巴胺殘留量的固相萃取-氣相色譜-質(zhì)譜分析方法，并且鹽酸克倫特羅和鹽酸萊克多巴胺的檢出限分別為0.30 μg/kg和 1.00 μg/kg[10]。王紅（2007）也簡化了方法，測定了動物肝臟組織中的鹽酸克倫特羅[11]。本方法所需設(shè)備昂貴，操作繁瑣，分析檢測前要對分子上羥基、氨基等極性基團(tuán)衍生化，難以作為常規(guī)方法應(yīng)用，不能進(jìn)行現(xiàn)場檢測。

3 免疫分析法

3.1 酶聯(lián)免疫分析

目前，檢測鹽酸克倫特羅較高效的免疫分析技術(shù)是酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）。該方法檢測下限一般為1.0 μg/L（ 尿 樣 ）、0.5 μg/kg（ 組織）。使用該法，酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測限尿液為0.3～1.0 ng/mL，組織為0.2～1.0 ng/mg。國內(nèi)外有許多檢測試劑盒，但質(zhì)量不一。酶聯(lián)免疫吸附測定法作為鹽酸克倫特羅殘留量的篩選方法具有操作簡便、準(zhǔn)確、投資小、成本低、速度快、靈敏度高、儀器設(shè)備簡單等優(yōu)點(diǎn)，適合對活體動物作大批量樣品的快速分析；缺點(diǎn)是仍不能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測，且該法檢測結(jié)果假陽性率較高，尤其當(dāng)樣品中含有抗生素或磺胺類藥物時，會使假陽性率進(jìn)一步提高[12]。

3.2 放射免疫分析技術(shù)

Ropitar和Zimmer首次報(bào)道用于β-2腎上腺素能激動劑的放射免疫測定程序和動物組織中鹽酸克倫特羅的藥理學(xué)研究。Delahaut等描述了建立更為特異的放射免疫方法，其中抗鹽酸克倫特羅的抗體對其他β-2腎上腺素能激動劑的交叉反應(yīng)小于10%，最低檢測限可達(dá)到0.5 ng/g。目前國外已生產(chǎn)出測定鹽酸克倫特羅的試劑盒產(chǎn)品，還建立了類似放射免疫分析法的放射受體分析法，這是用受體代替抗體結(jié)合鹽酸克倫特羅，檢測限可達(dá)到2.4 ng/g[13]。

放射免疫分析技術(shù)雖然具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便、快速、易標(biāo)準(zhǔn)化、技術(shù)成熟等優(yōu)點(diǎn)。但儀器價格昂貴和必須使用放射性同位素作為標(biāo)記物，存在著輻射防護(hù)及防止污染的問題，且試劑盒使用時間短，而且每次操作都要做標(biāo)準(zhǔn)曲線，可測量范圍相對較窄，難以實(shí)現(xiàn)操作及測量的自動化等。

3.3 滴金免疫技術(shù)

原理通過鹽酸克倫特羅CL（或萊克多巴胺RAC）與CL-BSA（鹽酸克倫特羅-牛血清白蛋白）偶聯(lián)物（或RAC-BSA）競爭結(jié)合抗CL（或RAC）單克隆抗體-膠體金復(fù)合物，使試紙上反應(yīng)線顏色變化，以判定樣品中CL（或RAC）的含量。當(dāng)檢樣中CL（或RAC）濃度低于最低檢測水平時，膠體金中的抗CL（或RAC）單抗-膠體金復(fù)合物與T線上的CL-BSA偶聯(lián)物（或RAC-BSA）結(jié)合，T線呈色與C線相近：當(dāng)檢樣中CL（或RAC）濃度大于5 ng/mL時，抗CL（或RAC）單抗-膠體金復(fù)合物與CL（或RAC）結(jié)合，T線顯色比C線淺或完全看不到線，且CL（或RAC）濃度越高T線顯色越淺，從而作出判定。滴金免疫技術(shù)具有簡便易行、快速、試劑安全、特異性高、可單份測定、不需要特殊儀器和設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，且金標(biāo)試劑比酶試劑更穩(wěn)定，冷凍干燥后可長期保存，便于常規(guī)應(yīng)用。

3.4 時間分辨熒光免疫分析技術(shù)

時間分辨熒光免疫分析技術(shù)（TRFIA）是一種新型的超微量的非放射性標(biāo)記免疫分析技術(shù)，它以鑭系元素為標(biāo)記物。時間分辨熒光免疫分析技術(shù)集酶標(biāo)記免疫分析和放射免疫分析等優(yōu)點(diǎn)于一身，且克服了酶標(biāo)記物的不穩(wěn)定性、化學(xué)發(fā)光僅能一次發(fā)光且易受環(huán)境干擾和電化學(xué)發(fā)光的非直接標(biāo)記等缺點(diǎn)，降低了非特異性信號，達(dá)到了極高的信噪比，大大地超過了放射性同位素所能達(dá)到的靈敏度，且還具有標(biāo)記物制備方便、儲存時間長、無放射性污染、檢測重復(fù)性好、操作流程短、標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬、不受樣品自然熒光干擾、應(yīng)用范圍廣泛等優(yōu)點(diǎn)。因此，越來越受到人們的關(guān)注。目前，國內(nèi)外應(yīng)用于鹽酸克倫特羅檢測的時間分辨熒光免疫分析技術(shù)的報(bào)道還較少，隨著技術(shù)的越來越成熟，其應(yīng)用將更廣泛。如果研制成檢測鹽酸克倫特羅的時間分辨熒光免疫分析技術(shù)試紙條，將可對鹽酸克倫特羅的殘留進(jìn)行現(xiàn)場檢測[13]。

4 生物傳感器技術(shù)

將生物技術(shù)與微電子技術(shù)相結(jié)合，利用生物體內(nèi)抗原、抗體專一性結(jié)合而導(dǎo)致電化學(xué)變化設(shè)計(jì)成免疫生物傳感器。將CL（或RAC）抗體微型化膜固定于換能器（工作電極）表面，測定時在待測樣品溶液中加入已知濃度的酶標(biāo)激素，CL（或RAC）與標(biāo)記抗原競爭性地結(jié)合電極上的抗體，使經(jīng)洗滌后的電極與底物溶液接觸，標(biāo)記酶催化底物發(fā)生相應(yīng)的化學(xué)變化，轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘栞敵?，輸出顯示和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)將信息進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和輸出，直接顯示測得CL（或RAC）的含量。

國外已有用生物傳感器技術(shù)檢測CLB殘留的資料報(bào)道, 如Pizzariello Andrea 應(yīng)用分子印跡聚合膜（MIP）作為分子識別系統(tǒng)，選擇固相基質(zhì)復(fù)合電極（SBMCE）作為換能器，微分脈沖電壓電流表（DPV）作為輸出顯示裝置檢測牛肝臟中CLB殘留，結(jié)果此方法特異性強(qiáng)，與其他同類物質(zhì)交叉反應(yīng)低，缺點(diǎn)是反應(yīng)時間較長，靈敏度還有待于提高[14]。目前酶免疫傳感器的靈敏度達(dá)0.01 μg/kg，而且可在幾分鐘之內(nèi)完成檢測全過程。目前研制成功的檢測鹽酸克倫特羅的酶免疫傳感器，檢 測 限 為 0.3 μg/kg， 可 在 10 min內(nèi)完成檢測全過程，且傳感器體積?。?5 cm×7 cm×2 cm），便于攜帶和實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測[15]。生物傳感器具有選擇性好、響應(yīng)速度快、樣品用量少、操作簡易、價格低廉、定量準(zhǔn)確，且其結(jié)構(gòu)簡單、體積小、攜帶和使用方便、可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)的在線檢測和反復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)。

5 毛細(xì)管電泳法

Gausephol和 Blaschke（1998）應(yīng)用毛細(xì)管區(qū)帶電泳法檢測人尿中鹽酸克倫特羅的殘留，最低檢測限達(dá)到0.5 μg/L，而且精確度和準(zhǔn)確度均符合生物樣品中殘留物的檢測標(biāo)準(zhǔn)[16]。

毛細(xì)管區(qū)帶電泳法分離效率可達(dá)幾百萬理論塔板數(shù)，操作簡便，快速，所需樣品量極少，而且靈活性大，許多分離參數(shù)可以調(diào)節(jié)，但是所需儀器非常昂貴和復(fù)雜。

綜上所述，酶聯(lián)免疫吸附測定法、放射免疫分析技術(shù)、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法、色譜法都不能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測，而且檢測設(shè)備和檢測費(fèi)用昂貴，生物傳感器技術(shù)、滴金免疫技術(shù)和時間分辨熒光免疫分析技術(shù)靈敏，檢測快速和方便，是今后研究和開發(fā)檢測鹽酸克倫特羅等殘留物的重要方向。

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