膽酸鈉多克隆抗體的制備及其快速檢測方法研究

陳江源，劉 潔，蔡建中，付云潔，劉志國

（1.江漢大學 衛(wèi)生技術(shù)學院，湖北 武漢 430016； 2.江漢大學 文理學院，湖北 武漢 430056；3.武漢工業(yè)學院 生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023）

膽汁酸是膽固醇在肝細胞內(nèi)經(jīng)酶催化的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，是膽汁的主要成分，以鈉鹽或鉀鹽的形式存在于膽汁中。

膽汁酸代謝與膽固醇等脂類物質(zhì)的消化、吸收、代謝及調(diào)節(jié)關(guān)系密切。一方面，膽汁酸是膽固醇在體內(nèi)代謝的主要去路；另一方面，膽汁酸是具有親水與疏水基團的乳化劑，在促進腸道脂類的消化與吸收方面發(fā)揮重要作用；此外，膽汁酸還具有調(diào)節(jié)膽固醇的合成與轉(zhuǎn)化的作用。膽汁酸代謝紊亂與膽結(jié)石、肝病的關(guān)系密切。例如，膽汁酸除可抑制膽固醇在膽汁中析出沉淀（結(jié)石）外，還具有防止膽石生成的作用［1］，提高膽汁中膽汁酸濃度，可降低膽色素濃度及抑制結(jié)石的形成等作用［2］。

結(jié)石及其并發(fā)的肝膽管癌以及各種肝病可引起血清膽汁酸量的變化［3－4］。近年來的研究表明：血清膽汁酸是唯一可同時反映肝細胞分泌、合成功能及肝細胞損傷狀態(tài)三個方面的血清學指標［5］。因此，方便、快速及準確地檢測膽汁酸的含量，對于疾病的診斷具有重要臨床意義。

目前，臨床上血清膽酸鈉的測定多采用循環(huán)酶速率法和反相高效液相色譜法檢測血清膽汁酸［3，6］，雖然這些檢測方法的精密度可滿足臨床檢測的要求，但存在費時及檢測設(shè)備昂貴等缺陷。近年來，免疫膠體金技術(shù)在早孕及HIV檢測等許多領(lǐng)域得到了快速發(fā)展和應(yīng)用，因此，本文通過制備抗膽酸鈉多克隆抗體，為免疫學方法快速檢測膽汁酸含量的應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。

1 實驗材料及儀器

雄性新西蘭白兔，體重約2 kg，華中科技大學同濟醫(yī)學院動物中心提供；膽酸鈉購于上海生工生物工程有限公司；弗氏完全佐劑（Complete Freund’s adjuvant）、 弗氏不完全佐劑（Incomplete Freund’s adjuvant） 以及 HRP－羊抗兔抗體購于武漢捷瑞生物有限公司；硝酸纖維素膜、玻璃纖維、吸收墊、樣品墊均為美國Millipore公司產(chǎn)品；氯金酸（HAuCl4·4H2O）購于國藥集團化學試劑有限公司；紫外掃描儀：天美8500；冷凍離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司；透射電鏡：JapanH600；單維平面劃膜儀、切片機為上海金標科技有限公司產(chǎn)品；ELISA檢測酶標儀：奧地利SUNRISE公司。

2 實驗方法

2.1 抗膽酸鈉多克隆抗體的制備

膽酸鈉－牛血清白蛋白（BSA）免疫抗原的合成方法為：將載體蛋白BSA 100 mg和膽酸鈉100 mg 按照 1∶1 的比例混合在 25 mL PBS（0.02 mol／L， pH 7.4）中。 混勻后加入水溶性碳化二亞胺（EDC）75 mg，攪拌 1 ～2 h，充分混合后在室溫放置 24 h， 然后反應(yīng)液在 0 .15 mol／L 的 N aCl溶液中透析3 d，以除去多余的水溶性碳二亞胺。紫外掃描鑒定合成產(chǎn)物。低溫冷凍干燥后即可獲得膽汁酸鈉－BSA全抗原。用上述方法合成包被抗原膽酸鈉－卵清蛋白（OVA）。

采用常規(guī)免疫程序［7－8］免疫新西蘭白兔， 制備多克隆抗體。選擇體重2 kg左右的雄性新西蘭白兔4只，免疫2只，另外2只作為空白對照。首次免疫時將2 mg／mL完全抗原與完全弗氏佐劑按體積1∶1混合乳化后注入動物，在背部皮下注射8點，每點0.1 mL。每隔10 d用不完全弗氏佐劑乳化相同濃度的完全抗原，分別在腳趾、背部、腿部進行注射以加強免疫，每次1 mL。免疫中期采用膠體金免疫層析實驗檢測抗體與抗原反應(yīng)性，免疫終期用ELISA檢測抗體效價。

將獲得的抗血清用飽和硫酸銨法［9－10］純化，向2 mL預處理的血清中加入等體積pH 7.4的0.01 mol／L PBS 緩沖液， 在 4 °C 冰浴下 30 min 內(nèi)邊攪拌邊緩慢加飽和硫酸銨溶液到樣品溶液中，使?jié)舛茸優(yōu)?0 .5∶1（V／V）。 將溶液放在磁力攪拌器上4℃攪拌過夜。在4℃ 3000 r／min離心30 min，保留上清液。上清液再加飽和硫酸銨到0.5∶1（V／V）， 再次離心得到（二次）沉淀， 將沉淀溶于少量 （10 ～20 mL）PBS－0.2 g／L NaN3（pH 7.40.01 mol／L）中， 于 4 ℃ 透 析 24～48 h， 每隔3～6 h更換透析液一次，以徹底除去硫酸銨。純化結(jié)束后，加入終濃度為0.01%的NaN3，分裝成0.1 mL 的小份， 置－70°C 低溫保存。

2.2 間接ELISA法對特異性抗體效價的測定

用包被抗原膽酸鈉－OVA包被酶標板，純化后的抗體經(jīng)梯度稀釋，稀釋倍數(shù)分別為 1 ∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000、1∶32000，進行間接ELISA實驗，測定丙烯酰胺特異性抗體的效價［11］。同時將免疫前的兔血清作為陰性對照。

2.3 膠體金免疫層析試紙條的制備及檢測

2.3.1 金標抗原的制備 取 10 mL 24.5 nm 粒徑膠體金溶液［12］，用 0.2 mol／L 的 K2CO3調(diào)節(jié)金溶膠至pH為9.0。于事先確定的最佳標記蛋白量（200 μg）將膽酸鈉－OVA 與膠體金結(jié)合， 緩慢攪拌15 min，然后加入終濃度為 0.02%的 PEG 20000，繼續(xù)攪拌至其溶解。于4℃2500 r／min低速離心25 min。取上清，于10000 r／min離心35 min，棄上清。然后用稀釋液 （含8%蔗糖，0.05%Tween－20， 0.5%BSA 的 p H 7.4 的 0 .01 mol／L PBS）將沉淀恢復到原體積，再置于4℃10000 r／min離心35 min，取金標抗原沉淀，將其恢復至原體積的1／10，即1 mL。4℃保存?zhèn)溆茫?3］。

2.3.2 檢測卡的組裝與測試 用劃膜儀將 0 .5 mg／mL的抗膽酸鈉－BSA抗體與羊抗兔抗體在NC 膜上劃線（180 s／cm），分別作為檢測線（T）和質(zhì)控線（C）， 室溫干燥后， 浸入封閉液 （ pH 7.2，0.01 mol／L PBS， 1%BSA） 封閉 20 min， 37℃烘干待用。將玻璃纖維浸在處理液 （ 1%BSA，0.2%NaN3， 5% 蔗糖的 0 .01 mol／L PBS） 中 10 min，37℃烘干后作為金標抗原結(jié)合墊備用。將制備好的免疫金噴涂在金標抗原結(jié)合墊上。在PVC板上按圖1順序粘上樣品墊、免疫金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊［14］。用斬切機將制備好的PVA板切割成4 mm寬的試紙條，放入帶干燥劑的試紙筒中密閉避光儲存。

圖1 試紙示意圖

用樣品液配制標準系列的膽酸鈉溶液 （濃度分 別 為 0 、 4、 8、 12、16、20 μg／mL）， 分 別 取100 μL滴加在檢測卡的樣品區(qū)，每個濃度設(shè)置5個重復。10 min取出觀察陰性和陽性結(jié)果。若C、T線亮度基本一致或C線淺于T線表示陰性結(jié)果；若C線亮度明顯亮于T線則表示陽性結(jié)果；均未出現(xiàn)C、T兩線表示該試紙條失效。

為了定量分析，將不同膽酸鈉濃度競爭產(chǎn)生的顏色線通過凝膠成像系統(tǒng)測定其吸光度值，以金標抗原與固相抗體的結(jié)合比為縱坐標，以被測液中膽酸鈉濃度為橫坐標繪制曲線，進行定量分析。 結(jié)合比為 Ii，Ii＝Ai／A0， Ai指在不同的膽酸鈉濃度下檢測線的吸光度值，A0指在無膽酸鈉時檢測線的吸光度值。變異系數(shù)（CV）＝S／M×100%，S為標準差，M為Ii均值。

3 結(jié)果與分析

3.1 膽酸鈉－BSA免疫抗原的制備

用碳二亞胺法耦聯(lián)膽酸鈉－BSA及膽酸鈉－OVA后，進行紫外掃描，結(jié)果如圖2、圖3所示。

由圖2可知，BSA在220 nm和270 nm處有特征吸收峰，膽酸鈉在206 nm處有特征吸收峰。由于膽酸鈉－BSA在210 nm和260 nm處有均吸收峰，說明該耦聯(lián)物既具有膽酸鈉的吸收峰，又具備了BSA的吸收峰。結(jié)果表明膽酸鈉與BSA基本耦聯(lián)，可以作為免疫全抗原進行免疫程序。

圖2 膽酸鈉與BSA的紫外吸收光譜

由圖3可知，OVA在220 nm和270 nm處有特征吸收峰，膽酸鈉－OVA在210 nm和270 nm處有吸收峰，說明兩種物質(zhì)耦聯(lián)后是吸收峰發(fā)生偏移，既具有膽酸鈉的特征峰，又具有OVA的特征峰，表示包被抗原膽酸鈉－OVA基本耦聯(lián)。

圖3 膽酸鈉與OVA的紫外吸收光譜

3.2 膽酸鈉特異性抗體效價的測定

間接ELISA實驗測定膽酸鈉特異性抗體的效價結(jié)果如下：陰性孔的平均OD值為0.175，空白孔的平均OD值為0.045。變異系數(shù) （CV%）＝S／M×100%，S為標準差，M為OD均值。

判定陽性值以數(shù)值大于陰性值的2.1倍為標準，結(jié)果見圖4。由圖4可知用碳二亞胺法制備的完全抗原，抗膽酸鈉血清在 8×104倍以下時，陽性血清在492 nm的吸光度值大于陰性值的2.1倍。因此抗體的效價大于 8×104。這表明用碳二亞胺法合成的全抗原具有較高的免疫原性。此外，批內(nèi)的變異系數(shù)均小于7.5%，說明重復孔穩(wěn)定性較好，效價值較穩(wěn)定。

圖4 膽酸鈉特異性抗體效價的確定

3.3 免疫金探針的鑒定

用有Formvar膜的鎳網(wǎng)蘸取金標蛋白溶液，在空氣中干燥后用醋酸鈾復染，在TEM下觀察，可以看到金顆粒周圍有一明顯的空暈，結(jié)果表明顆粒表面吸附有蛋白質(zhì)分子，膠體金標記抗原基本成功。

3.4 免疫層析試紙條的測試與分析

試驗結(jié)果顯示，膽酸鈉濃度達12 μg／mL時，與陰性結(jié)果比較，檢測線T的顏色明顯變淡，即試紙條的檢測限為 12 μg／mL（圖 5）。

圖5 試紙條的測試結(jié)果

對檢測線掃描后做密度分析，結(jié)果顯示如圖6所示，試紙條在樣品液中的數(shù)值測試結(jié)果為：在膽酸鈉濃度為0～20 μg／kg范圍內(nèi)，其濃度的對數(shù)與結(jié)合比線性回歸方程為 y＝－3.84x＋95.68， R2＝0.982， 可以用于膽酸鈉殘留的定量分析。各重復數(shù)值的變異系數(shù)≤9.41%。

圖6 對試紙條的掃描分析結(jié)果

4 討論

目前，隨著生活水平的提高與飲食習慣的改變，結(jié)石及其并發(fā)肝膽管癌的發(fā)病率呈上升趨勢，我國開展中西醫(yī)結(jié)合治療膽石癥的經(jīng)驗也越來越豐富［4］，而血清膽汁酸是反映肝功能狀態(tài)的最靈敏的指標之一［5］。因此，方便、快速、準確地檢測膽汁酸的含量，對于結(jié)石、肝膽管癌及各種肝病的診斷具有重的臨床意義。

膠體金免疫層析法，作為一種半定量的檢測方法，其特點是快速、簡便。本實驗應(yīng)用膠體金免疫層析法，研制的膽酸鈉檢測試紙，性能穩(wěn)定、重復性好，通過可見的顏色反應(yīng)，膽酸鈉的最低檢測限為 12 μg／mL，只需 5 min即可完成檢測，可以為臨床提供初步的檢測結(jié)果。

免疫全抗原的合成是成功制備多克隆抗體的重要因素之一。本文運用碳二亞胺法將膽酸鈉與BSA、OVA耦聯(lián)，通過紫外掃描的方法測定出免疫抗原及包被抗原已基本耦聯(lián)。

間接酶聯(lián)吸附方法中，包被抗原的濃度不宜高于10 μg／mL，本實驗所用的包被抗原膽酸鈉－OVA 經(jīng)優(yōu)化后的濃度為 0.5 μg／mL， 結(jié)果比較理想。抗膽酸鈉特異性抗體的效價達到了8×104。

綜上所述，本文應(yīng)用免疫學方法研制的膽酸鈉檢測試紙，可方便、快速檢測膽酸鈉的含量，也可繼續(xù)采用親和性更高的單克隆抗體，進一步提高檢測的靈敏度或提高檢測限。本研究克服了檢測中設(shè)備昂貴、操作復雜、費時、成本高等問題，為今后運用免疫學技術(shù)方便、快速地檢測膽酸鈉的含量提供了有力的技術(shù)支持，在將來結(jié)石、肝膽管癌及肝病的診斷中具有重要的應(yīng)用價值。

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