火龍果莖段組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究

王云山，周美虹，康黎芳，曹冬梅，張 超，段九菊

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，山西太原030031；2.太原市迎澤李園農(nóng)業(yè)科技培育場，山西太原030045）

火龍果（Hylocereus undatus）又稱紅龍果、仙蜜果，屬仙人掌科三角柱屬，原產(chǎn)于墨西哥等中美洲地區(qū)，是一種具有較高經(jīng)濟(jì)價值和保健美容作用的新興水果[1]?；瘕埞仓隇槎嗄晟赓|(zhì)植物，花蕾似漏斗，一般于傍晚開花，凌晨逐漸凋萎。自花授粉，但坐果率低，因此，一般采用人工授粉。不同品種的火龍果果肉顏色不同，有白色、紅色、黃色、紫紅色等，而且營養(yǎng)價值極高，含有豐富的維生素、纖維素、葡萄糖及人體所需K，Ca，Mg等多種礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)，但脂肪含量較少[2-3]。另外，火龍果耐旱、耐瘠薄，抗性強，能夠在旱坡地種植，具有保持水土、減少沙化、改善生態(tài)環(huán)境的作用[4-5]。因此，其在生產(chǎn)上具有較大的發(fā)展前途及經(jīng)濟(jì)價值。

目前，火龍果的繁殖主要通過種子、扦插、嫁接等方式，這些方法的繁殖速度較慢，又受繁殖材料供應(yīng)的限制，很難滿足市場的需求。近年來，科研工作者一直嘗試用組織培養(yǎng)的方式繁殖火龍果[6-14]，且已取得了一定的成效。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，探索用火龍果幼嫩莖段作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，以達(dá)到快速繁殖的目的，從而實現(xiàn)火龍果的工廠化生產(chǎn)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗以火龍果幼嫩莖段作為外植體，供試材料于2010年7月取自太原市迎澤李園農(nóng)業(yè)科技培育場。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體的取材 從溫室中生長健壯的火龍果母株上，剪取 2～3，5～7，15～17 cm共 3種長度的帶刺座幼嫩莖段作為外植體，觀察不同外植體對愈傷組織誘導(dǎo)以及刺座不定芽萌發(fā)的影響。

1.2.2 外植體的滅菌 剪取生長健壯的母莖上的新生莖段，在洗衣粉液中用軟毛刷刷洗并用流水沖洗干凈，然后置于超凈工作臺內(nèi)用鑷子小心剝?nèi)ゴ套系男〈毯兔?，之后?5%的酒精快速消毒30 s，然后將莖段置于0.1%的升汞溶液中浸泡消毒。其中，流水沖洗時間設(shè)0.5，1 h 2個處理，0.1%的升汞溶液消毒時間設(shè)7，10，15 min共3個處理，組成6個組合。表面消毒完成后用無菌水沖洗4次，每次5 min左右。消毒過程中要攪拌外植體，使其充分接觸消毒液，提高消毒效果。將消毒后的莖段橫切成1.5 cm左右長的莖段，基部向下接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。培養(yǎng)1周后，統(tǒng)計其污染率和褐死率。

1.2.3 外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選 沿波浪形棱緣縱向切成長×寬為1.5 cm×1.5 cm、帶有刺座的小塊（去除髓部及藥劑接觸過的傷口），每塊上均留有1個刺座，垂直接種在培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的6-BA和NAA，蔗糖30 g/L，瓊脂5 g/L，pH值為5.8。6-BA質(zhì)量濃度分別為 2，4，5，8，10 mg/L，共 5 個水平；NAA分別為 0.05，0.1，0.2 mg/L共 3個水平，共計15個處理。

每個處理10瓶，每瓶2塊，培養(yǎng)45 d，統(tǒng)計其刺座不定芽的誘導(dǎo)率。培養(yǎng)室溫度為（25±3）℃，每天光照 12 h，光照強度 1 500～2 000 lx。

1.2.4 分化增殖培養(yǎng)基篩選 將誘導(dǎo)出的不定芽切成3～5個芽作為一叢（大小、長勢要一致），接種于分化增殖培養(yǎng)基上，進(jìn)行不定芽分化增殖?；九囵B(yǎng)基為MS，瓊脂為5 g/L，蔗糖30 g/L，激素 6-BA 質(zhì)量濃度為 1.0，3.0，5.0，8.0 mg/L，共4個水平；激素NAA質(zhì)量濃度為0.05，0.1，0.2 mg/L，共3個水平。合計12個處理。

每個處理5瓶，每瓶3塊，培養(yǎng)30 d，統(tǒng)計其刺座不定芽的增殖率。

1.2.5 生根培養(yǎng)基篩選 取同一增殖培養(yǎng)基中生長健壯、高達(dá)2 cm以上的小苗接種到生根培養(yǎng)基中，生長30 d后統(tǒng)計其生根情況?；九囵B(yǎng)基為：大量元素減半的1/2 MS，瓊脂5 g/L，蔗糖30 g/L。IBA質(zhì)量濃度分別為 0.3，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0 mg/L，共7個水平；NAA質(zhì)量濃度分別為0.5，2.0 mg/L，共2個水平。為了研究活性炭對生根褐化的影響，另加1個IBA 1.0 mg/L＋活性炭2 g/L的處理，共10個處理。

每個處理5瓶，每瓶3～6塊。生長30 d觀察其生根情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅菌方法對火龍果外植體的影響

從表1可以看出，以火龍果母莖上的新生莖段為材料，用0.1%的升汞消毒15 min的污染率最低，但消毒15 min的材料大部分刺座及莖棱組織有褐化并逐漸壞死的現(xiàn)象，說明15 min的消毒時間過長，莖段的組織細(xì)胞被殺死。這與周傳明等[15]報道的火龍果外植體在不同消毒時間過程中的現(xiàn)象是一致的。綜合考慮，材料滅菌以流水沖洗0.5 h＋75%酒精消毒30 s＋0.1%的升汞消毒10 min處理最佳。

表1 不同滅菌方法對火龍果外植體的影響

2.2 不同外植體對愈傷組織誘導(dǎo)及刺座不定芽萌發(fā)的影響

從表2可以看出，不同長度的帶刺座棱片均能產(chǎn)生愈傷組織，刺座上的不定芽大部分可以啟動生長，但有差異，其中，以2～3 cm長的幼嫩莖段誘導(dǎo)效果最佳。外植體接種1周后，切口變厚，切口處產(chǎn)生疏松的淡綠色愈傷組織，20 d后切口表面突起呈半球狀，形成綠色愈傷組織。刺座則在10～14 d后長出帶有白色茸毛的小突起，20～30 d后不定芽萌出，形成一個類似鹿角狀的組織。

表2 不同外植體對愈傷組織誘導(dǎo)及刺座不定芽萌發(fā)的影響

2.3 不同培養(yǎng)基對火龍果外植體刺座不定芽誘導(dǎo)分化的影響

本研究采用的誘導(dǎo)火龍果刺座不定芽分化的激素組合為6-BA和NAA，其不同質(zhì)量濃度組合對不定芽誘導(dǎo)分化的影響如表3所示。

從表3可以看出，火龍果在MS附加不同質(zhì)量濃度的 6-BA（2～10 mg/L）和 NAA（0.05～0.2 mg/L）的培養(yǎng)基上均能誘導(dǎo)刺座產(chǎn)生不定芽。在本試驗條件下，當(dāng)較高質(zhì)量濃度的6-BA（4～8 mg/L）與適宜質(zhì)量濃度NAA組合（處理4～8，10，11）時，外植體刺座不定芽誘導(dǎo)率較高，達(dá)50%～75%；當(dāng)較低質(zhì)量濃度的6-BA（2 mg/L）與 NAA（0.05～0.2 mg/L）組合（處理 1，2，3）時，刺座不定芽分化率較低，僅為5%～25%。當(dāng)NAA質(zhì)量濃度相同、6-BA質(zhì)量濃度降低，或6-BA質(zhì)量濃度相同、NAA質(zhì)量濃度提高時，大部分表現(xiàn)為不定芽分化率下降。綜上所述，不同的激素質(zhì)量濃度組合對火龍果刺座不定芽的誘導(dǎo)效果不同，以4 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA組合時效果最好，其刺座不定芽分化率最高，可達(dá)到75%。

表3 不同培養(yǎng)基對火龍果刺座芽誘導(dǎo)分化的影響

2.4 不同培養(yǎng)基對芽增殖與生長的影響

由表4可知，當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為8 mg/L，NAA質(zhì)量濃度為0.05 mg/L（處理10）時，不定芽的繁殖系數(shù)最高，達(dá)6.0，但其不定芽生長緩慢，呈細(xì)弱狀，且褐化現(xiàn)象嚴(yán)重。當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為1 mg/L，NAA質(zhì)量濃度為0.2 mg/L時，雖然不定芽的繁殖系數(shù)低，但其不定芽生長較快、苗壯。在NAA質(zhì)量濃度相同時，隨6-BA質(zhì)量濃度的增加，芽的繁殖系數(shù)隨之增加，同時不定芽生長減緩，長勢減弱且褐化嚴(yán)重。當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度相同，NAA質(zhì)量濃度提高時，不定芽繁殖系數(shù)則下降，氣生根增多。

在繼代過程中，可以根據(jù)生產(chǎn)的需要先在6-BA 8 mg/L＋NAA 0.05 mg/L培養(yǎng)基中培養(yǎng)7～10 d，待刺座上長出許多小突起，再轉(zhuǎn)接于6-BA 1 mg/L＋NAA 0.2 mg/L培養(yǎng)基中進(jìn)行生長培養(yǎng)。這樣交替培養(yǎng)，可以調(diào)節(jié)不定芽的增殖與生長，從而達(dá)到既有較快的繁殖速度，又能保證有較好的小苗且減少褐化苗的目的。

表4 不同培養(yǎng)基對芽增殖與生長的影響

2.5 不同培養(yǎng)基對火龍果生根的影響

從表5不同培養(yǎng)基對火龍果生根的影響可以看出，IBA在0～3 mg/L范圍內(nèi)，生根率和生根數(shù)隨著濃度的升高而提高，尤其以1/2 MS＋I(xiàn)BA 2.0 mg/L處理的生根效果最好，生根率為86.96%，平均每株生根數(shù)5條。培養(yǎng)7～10 d開始有氣生根生出。當(dāng)IBA質(zhì)量濃度達(dá)4.0 mg/L時，對根的形成起抑制作用。結(jié)果還表明，IBA的生根效果比NAA好。添加活性炭（處理4）雖可減輕根的褐化，但與處理3相比，抑制了生根，因此，活性炭對生根沒有益處。

表5 不同培養(yǎng)基對火龍果生根的影響

3 結(jié)論與討論

外植體表面滅菌的關(guān)鍵是選擇合適的消毒劑和消毒時間，而消毒劑中，以升汞的殺菌能力最強、最常用，但它對外植體的傷害也最大，不易去除。消毒時間太長，外植體吸入升汞量較多，輕者會對外植體產(chǎn)生毒害，抑制細(xì)胞分裂和新陳代謝，使芽苗生長減弱，重者會使外植體中毒死亡。本試驗結(jié)果表明，火龍果幼嫩莖段的滅菌以流水沖洗0.5 h＋75%酒精30 s＋0.1%升汞10 min處理最佳。污染多數(shù)在芽眼的叢刺處出現(xiàn)，這是由火龍果莖段芽眼處有成叢的葉刺，外植體不易清洗干凈，消毒劑也較難透入，滅菌不徹底造成的。

在組織培養(yǎng)過程中，芽苗的發(fā)育受到細(xì)胞分裂素與生長素比例高低的調(diào)控，細(xì)胞分裂素能誘導(dǎo)不定芽形成，削弱頂端優(yōu)勢，促進(jìn)側(cè)芽的萌發(fā)；而生長素能促進(jìn)細(xì)胞伸長，加強頂端優(yōu)勢。當(dāng)細(xì)胞分裂素與生長素濃度比例適當(dāng)時，二者能互相協(xié)同作用，有利于不定芽的形成。

本試驗結(jié)果表明，不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS＋6-BA 4.0 mg/L＋NAA 0.1 mg/L最佳。當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為8 mg/L和NAA質(zhì)量濃度為0.05 mg/L時，不定芽的繁殖系數(shù)最高；當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為1 mg/L和NAA質(zhì)量濃度為0.2 mg/L時，不定芽生長較快、苗壯，因此，可以根據(jù)生產(chǎn)的需要交替使用這2種培養(yǎng)基。適宜的生根培養(yǎng)基為1/2 MS＋I(xiàn)BA2.0 mg/L。

[1]張義勇，劉全國，魏奎.火龍果北方日光溫室栽培技術(shù)[J].河北林果研究，2004，19（3）：249-251.

[2]來寬忍，趙凱，史雙院.火龍果生物學(xué)特性及北方栽培技術(shù)[J].西北園藝，2006（8）：17-18.

[3]黃愛萍，姜帆，高惠穎，等.我國大陸火龍果引種栽培與利用現(xiàn)狀[J].臺灣農(nóng)業(yè)探索，2005（4）：44-45.

[4]呂春茂，范海延，姜河，等.火龍果日光溫室引種觀察及栽培技術(shù)[J].北方園藝，2003（1）：19-20.

[5]趙志平，楊春霞.火龍果的開發(fā)與發(fā)展前景 [J].中國種業(yè)，2006（2）：13-14.

[6]李梅，林德欽，張文珠.火龍果離體培養(yǎng)與快速繁殖[M].北京：中國科學(xué)技術(shù)出版社，2001.

[7]黃青峰.火龍果的棱片離體培養(yǎng)[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2002，17（3）：9.

[8]黃青峰，余成章.火龍果的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J].植物生理學(xué)通訊，2002，38（5）：452.

[9]崔波，武思，蔣素華，等.火龍果莖段再生體系的建立[J].北方園藝，2011（8）：146-147.

[10]陳廣超，謝曉明.林燕絨.火龍果組培快繁技術(shù)[J].中國南方果樹，2003，32（3）：31.

[11]肖三元，梁國平.紅掌組織培養(yǎng)及快速繁殖[J].云南熱作科技，2000，23（2）：12-13.

[12]余慧琳，張偉，朱一儀.紅仙蜜火龍果莖段離體快繁技術(shù)研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（9）：3951-3952.

[13]王以紅，陳平.紅龍果離體器官芽分化的研究[J].廣西熱作科技，2000（4）：14-15.

[14]楊巧云，鄒瓊，呂淑玉，等.日光溫室火龍果栽培技術(shù)[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004（1）：58.

[15]周傳明，黃壽先，熊英，等.火龍果莖段離體培養(yǎng)快速繁殖試驗[J].廣西科學(xué)，2002，9（1）：78-80.