昆蟲CYP4基因家族多樣性和進(jìn)化

王小青，劉 婷

（長(zhǎng)治市郊區(qū)農(nóng)業(yè)委員會(huì)，山西長(zhǎng)治046011）

CYP4基因家族屬于P450基因超家族中的一個(gè)基因家族，P450超家族蛋白是一組膜上同工酶，主要功能是代謝一些外源的有毒物質(zhì)及代謝和合成一些與生理功能有關(guān)的分子，如脂肪酸、前列腺素（prostaglandin，PG）、膽汁酸、膽固醇類的激素等[1]，由于進(jìn)化的壓力，P450表現(xiàn)出很明顯的多樣性[2]。目前，昆蟲中已鑒定出CYP4，CYP6，CYP9，CYP12，CYP18，CYP28 等 27 個(gè)家族，其中，除了CYP4家族外，全是昆蟲特異性家族[4]，這些基因家族都屬于P450基因超家族。在已測(cè)出全序列基因組的黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）中，P450 基因有 90 個(gè)，其中，超過1/2屬于CYP4和CYP6家族[5]。脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物都含有CYP4基因，CYP4基因家族是P450超家族中最古老的基因家族之一，起源于1 000多萬a以前，早于脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物分化[6]，其主要代謝昆蟲的內(nèi)源物質(zhì)（保幼激素、蛻皮激素、嗅覺有關(guān)的物質(zhì)[7]等），部分成員也可能在代謝外源物質(zhì)過程中起作用[8]，如黑腹果蠅的 CYP4E2[9]、棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）的CYP4G8等。

目前，研究昆蟲P450的進(jìn)化，CYP4是最好的材料。CYP4不是昆蟲所特有的基因家族，它具有較高的多樣性，可以通過其他動(dòng)物的CYP4來確定進(jìn)化的時(shí)間軸，有利于對(duì)分子進(jìn)化機(jī)制的研究。植食性昆蟲對(duì)寄主的專一性是同它降解植物毒素的能力密切聯(lián)系的[10]。CYP4基因家族在昆蟲與植物的相互作用中起著非常重要的作用，果蠅中的CYP4D10基因決定著其對(duì)一種仙人掌的寄主專一性[11]。所以，研究CYP4家族的進(jìn)化不僅僅能夠解釋一定的進(jìn)化機(jī)制，還能進(jìn)一步明確昆蟲與植物之間的關(guān)系，尤其是互利共生體系。

1 昆蟲CYP4家族的多樣性

長(zhǎng)期的進(jìn)化使得多樣性在生物界廣泛存在，如：物種的多樣性、生物大分子的多樣性、基因的多樣性等。作為細(xì)胞色素P450超家族中的一員，CYP4家族隨著進(jìn)化也表現(xiàn)出了各種多樣性。

1.1 昆蟲CYP4家族擁有眾多的亞家族及其成員和基因變異體

由表1可知，CYP4家族成員是非常龐大的，其中包含許多假基因。假基因是和功能基因在序列上極為相似，但是又不能產(chǎn)生具有功能的產(chǎn)物的基因。在果蠅的90個(gè)P450基因中，有7個(gè)假基因[5]，在德國(guó)小蠊（Blattella germanica）中發(fā)現(xiàn)3個(gè) CYP4C21假基因（CYP4C21P1，CYP4C21P2和CYP4C21P3）。還發(fā)現(xiàn)了P450的一些鑲嵌基因，即所謂的這段序列既有P450的特征序列，又含有與P450毫不相干的序列。這些鑲嵌序列的發(fā)現(xiàn)證明了內(nèi)部DNA的交換確實(shí)存在[6]。

表1 CYP4家族成員

1.2 同一種昆蟲不同生活史期各種CYP4基因表達(dá)不同

如火蟻中的CYP4AB1，CYP4AB2在成蟲中的表達(dá)量明顯多于蛹和幼蟲[12]，德國(guó)小蠊（Blattella germanica）中CYP4C21的nothern雜交結(jié)果表明，其在卵中的表達(dá)是十分微弱的，而在其他齡期蟲體中具有相似的表達(dá)[13]（圖1）。

在搖蚊中，CYP4G33基因在蛹和成蟲期的表達(dá)量較少，但是在各個(gè)蟲期均有表達(dá)[14]（圖2）。

1.3 不同種屬的昆蟲CYP4亞家族成員不同

目前，對(duì)昆蟲CYP4的研究主要集中在果蠅（Drosophila melanodaster）、按蚊（Anopheles gamibiae）、意大利蜜蜂（Apismellifera）等方面。已知從果蠅中鑒定的細(xì)胞色素P450CYP4家族的基因有：CYP4AC3，CYP4AA1，CYP4AC1，CYP4AC2，CYP4AD1，CYP4AE1，CYP4C3，CYP4D1，CYP4D2，CYP4D8，CYP4D14，CYP4D20，CYP4D21，CYP4E1，CYP4E2，CYP4E3，CYP4G1，CYP4G15，CYP4P1，CYP4P2，CYP4P3，CYP4S3；意大利蜜蜂中分離鑒定出 CYP4AA1，CYP4AV1，CYP4AZ1，CYP4G11[4]。在果蠅和蜜蜂中均有CYP4AA1基因，說明不同昆蟲可以含有相同的CYP4家族成員，這與CYP6家族基因不同[15]。但有些CYP4家族僅存在于一種昆蟲中，CYP4E僅存在于果蠅中，CYP4H僅在蚊子中發(fā)現(xiàn)[16]。

2 昆蟲CYP4家族的進(jìn)化

2.1 CYP4家族的自然進(jìn)化史

20世紀(jì)80年代以來，古生物學(xué)和地質(zhì)學(xué)的證據(jù)表明，地球上有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的生命至少在地質(zhì)時(shí)代的太古宙早期即距今約35億a前就已存在[17]，而細(xì)胞色素P450作為呼吸鏈的主要成分，應(yīng)該與此時(shí)間相一致。Feyereisen[16]提出，細(xì)胞色素P450早于大氣中氧的積累。

昆蟲中CYP4家族比其他昆蟲細(xì)胞色素P450家族更接近于哺乳動(dòng)物的CYP家族，因此，有可能CYP4家族是在哺乳動(dòng)物與昆蟲分化前通過基因復(fù)制產(chǎn)生的。

2.2 昆蟲CYP4的進(jìn)化機(jī)制

2.2.1 分子驅(qū)動(dòng)假說 分子驅(qū)動(dòng)用來解釋新的CYP4形成。分子驅(qū)動(dòng)是通過內(nèi)部DNA的變動(dòng)來改變種群的基因型的過程，這個(gè)過程是不受自然選擇影響的。這種內(nèi)部DNA的轉(zhuǎn)換機(jī)制多種多樣，包括基因復(fù)制、不等交換、基因的轉(zhuǎn)換和顛換、滑動(dòng)復(fù)制和RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移等[13]。在昆蟲中有許多基因簇，通常我們認(rèn)為這些基因簇是同一個(gè)祖先基因經(jīng)過基因復(fù)制和基因轉(zhuǎn)化而來的[9]。

2.2.2 自然選擇 CYP4基因超家族是植食性昆蟲降解植物次生代謝物質(zhì)主要的酶，所以，有一種假設(shè)認(rèn)為，來自于植物次生代謝物質(zhì)的選擇壓力是導(dǎo)致CYP4多樣性的一個(gè)重要因子。但是現(xiàn)在有能證明這一假設(shè)的直接證據(jù)極少。研究寡食性及專食性昆蟲可以為這一假設(shè)提供一定的數(shù)據(jù)[18]。Michael等[18]以2種鳳蝶中CYP6B1的進(jìn)化支持了以上假設(shè)。

2.2.3 動(dòng)植物的協(xié)同進(jìn)化 在昆蟲與植物的共生關(guān)系中，一方面，植物利用次生代謝物質(zhì)抵御其他植食性昆蟲的侵入；另一方面，昆蟲利用P450降解寄主植物產(chǎn)生的有毒次生代謝物質(zhì)[19-20]，正是在這種相互競(jìng)爭(zhēng)的協(xié)同進(jìn)化過程中，P450不斷地向前進(jìn)化。

3 研究昆蟲CYP4家族進(jìn)化的方法

對(duì)不同的P450分子間相互作用的早期研究是根據(jù)酶的催化活性、誘導(dǎo)性、免疫交叉反應(yīng)、亞細(xì)胞定位等進(jìn)行的，雖然這為闡明不同P450間的關(guān)系提供了重要的信息，但是在這方面的研究中，蛋白質(zhì)和DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)將包含更多的信息。隨著CYP4家族研究的不斷深入，一些重要的進(jìn)化研究方法逐漸被應(yīng)用于CYP4家族基因的研究。

3.1 基因不同部分的研究

3.1.1 外顯子 外顯子直接翻譯成蛋白質(zhì)，而最初研究P450基本上都是研究蛋白序列的，只是外顯子反映的信息應(yīng)該叫蛋白序列更準(zhǔn)確，因?yàn)?個(gè)氨基酸對(duì)應(yīng)3個(gè)密碼子，而且多個(gè)三聯(lián)體對(duì)應(yīng)1個(gè)氨基酸[21]。

3.1.2 內(nèi)含子 內(nèi)含子曾經(jīng)一度被視為“垃圾”，但是現(xiàn)在越來越受到進(jìn)化學(xué)家的青睞，因?yàn)閮?nèi)含子不像外顯子那樣具有功能，受外界的選擇壓力和功能的限制要小得多，所以，內(nèi)含子的進(jìn)化基本上反映了DNA本身的進(jìn)化，在進(jìn)化的研究上更有意義[22]。P450的進(jìn)化歷史實(shí)際上就是內(nèi)含子的獲得和失去的歷史[9]。

但是CYP4家族基因的內(nèi)含子的進(jìn)化研究的較淺，僅僅局限在長(zhǎng)度和位置上的差異[23]。

3.1.3 啟動(dòng)子等其他功能片斷 外顯子和內(nèi)含子的研究往往要求擴(kuò)增出足夠長(zhǎng)的基因片段，但是由于試驗(yàn)技術(shù)或者試驗(yàn)材料的限制，經(jīng)常只能拿到很小的一部分序列，這就要求將得到的序列進(jìn)行充分有效地分析。Hung等[24]對(duì)CYP6B亞家族基因的啟動(dòng)子序列進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)對(duì)1個(gè)物種中的CYP6B亞家族成員之間的比較可以為研究鳳蝶中各個(gè)基因的進(jìn)化的機(jī)制提供信息。所以，當(dāng)只是拿到了目的基因的一部分時(shí)，可以考慮研究它的啟動(dòng)子、兩端側(cè)翼區(qū)等特殊的區(qū)域。

3.2 蛋白序列的研究

蛋白序列的研究與外顯子的研究有一定的相似性，但是蛋白是最直接反映功能的生物大分子，可以運(yùn)用生物信息學(xué)的方法來預(yù)測(cè)蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)[25]，從而將蛋白和功能聯(lián)系起來[26]。而功能又往往與環(huán)境有關(guān)，我們就可以間接地把蛋白與環(huán)境聯(lián)系起來。地中海貽貝（Mytilus galloprovincialis）中的CYP4Y1的表達(dá)量就與外界的污染程度有關(guān)[27]。Li等[28]通過研究多食性和寡食性昆蟲反抵御（counterdefense enzymes），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CYP6B8要比CYP6B1具有更靈活的空間折疊，更具有彈性的催化口袋和更多的底物識(shí)別渠道。

4 結(jié)語(yǔ)

目前，對(duì)CYP4家族基因的研究主要集中在進(jìn)化上[23]，且大多比較簡(jiǎn)單，如內(nèi)含子的進(jìn)化主要局限在位置和長(zhǎng)度差異的研究上。Nelson[29]認(rèn)為，研究進(jìn)化時(shí)，僅僅比較序列來形成分支是不夠的，有必要去研究其他的特征：內(nèi)含子-外顯子的界限，空間結(jié)構(gòu)內(nèi)部或者之間的插入和缺失、一些基因簇特定的結(jié)構(gòu)。整個(gè)P450超家族基因都編碼著功能蛋白，所以，通過一些蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，建立結(jié)構(gòu)進(jìn)化樹，也是將來CYP4家族基因研究的方向。再就是加強(qiáng)研究假基因、鑲嵌基因、基因簇等，這些在整個(gè)細(xì)胞色素P450中是較多的。

[1]Negishi M，Iwasaki M.Structural flexibilityand functional versatility of cytochrome P450 and rapid evolution[J].Mutation Research，1995，350：43-50.

[2]Feyereisen R.Insect P450 enzymes[J].Annual Reviewof Entomology，1999，44（1）：507-533.

[3]Wang H，Donley K M.Organization and evolution of the Cyp2 gene cluster on mouse chromosome 7，and comparison with the syntenic human cluster[J].Environmental Health Perspectives，2003，111（15）：1835-1842.

[4]D R，F(xiàn)onseca N da，Antunes R R A，et al.Structural divergence and adaptive evolution in mammalian cytochromes P450 2C[J].Gene，2007，387（1/2）：58-66.

[5]Tijet N，Helvig C，F(xiàn)eyereisen R.The cytochrome P450 gene superfamily in Drosophila melanogaster：annotation，intron-exon organization and phylogeny[J].Gene，2001，262（1/2）：189-198.

[6]Bradfield，James Y，Lee.Cytochrome P450 family 4 in a cockroach:Molecular cloning and regulation by hypertrehalosemic hormone[J].Proc Natl Acad Sci USA，1991，88：4558-4562.

[7]Maibeche-Coisne M，Jacquin-JolyE.cDNAcloningof biotransformation enzymes belonging to the cytochrome P450 family in the antennae of the noctuid moth Mamestra brassicae[J].Insect Mol Biol，2002，11（3）：273-281.

[8]Anne J?rgensen L J R，Ole Andersen.Characterisation of two novel CYP4 genes from the marine polychaete Nereis virens and their involvement in pyrene hydroxylase activity[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2005，336：890-897.

[9]Boris C Dunkov，RosarioRodriguez-Arnaiz.R.Cytochrome P450 gene clusters in Drosophila melanogaster[J].Mol Gen Genet，1996，251（3）：290-297.

[10]Bassett M H，McCarthy J L.Sequence and developmental expression of CYP18，a member of a newcytochrome P450 family from Drosophila[J].Molecular and Cellular Endocrinology，1997，131：39-49.

[11]Frank MR，F(xiàn)ogleman J C.Involvement of cytochrome P450 in host-plant utilization by Sonoran Desert Drosophila[J].Proc Natl Acad Sci USA，1992，89：11998-12002.

[12]Liu N，Zhang L.CYP4AB1，CYP4AB2，and Gp-9 gene overexpression associated with workers of the red imported fire ant，Solenopsis invicta Buren[J].Gene，2004，327（1）：81-87.

[13]Zhimou Wen，C E H，Jeffrey G Scott.CYP9E2，CYP4C21 and related pseudogenes from German cockroaches，Blattella germanica：implications for molecular evolution，expression studies and nomenclature of P450s [J].Gene，2001，272（1/2）：257-266.

[14]Londono D K，Siqueira H A A.Cloning and Expression of an Atrazine Inducible Cytochrome P450，CYP4G33，from Chironomus tentans （Diptera:Chironomidae）[J].Pesticide Biochemistryand Physiology，2007，89（2）：104-110.

[15]Claudianos C，Ranson H.A deficit of detoxification enzymes:pesticide sensitivity and environmental response in the honeybee[J].Insect Molecular Biology，2006，15（5）：615-636.

[16]Feyereisen D W-R a R.Cytochromes P450：a success story[J].Genome Biology，2000，1（6）：1-9.

[17]張昀.生物進(jìn)化[M].北京：北京大學(xué)出版社，1998.

[18]Michale B Cohen，MA S，May R Berenbaum.A host-inducible cytochrome P450 from a host-specific caterpillar：Molecular cloning and evolution[J].Proc Nati Acad Sci USA，1992，89：10920-10924.

[19]Xianchun Li，Berenbaum M R.Molecular cloning and expression of CYP6B8：a xanthotoxininducible cytochrome P450 cDNAfromHelicoverpa zea[J].Insect Biochemistryand Molecular Biology，2000，30：75-84.

[20]Rewitz K F，Styrishave B.Marine invertebrate cytochrome P450：Emerging insights from vertebrate and insect analogies[J].Comparative Biochemistry and Physiology Part C：Toxicology&Pharmacology，2006，143（4）：363-381.

[21]Eric T Williams，A S R，Henry W Strobel.Defining relationships between the known members of the cytochrome P450 3A subfamily，includingfive putative chimpanzee members[J].Mol Phylogenet Evol，2004，33（2）：300-308.

[22]Albert DGde Roos.Origins ofintrons based on the definition of exon modules and their conserved interfaces[J].Bioinformatics，2005，21（1）：2-9.

[23]Tare`s S，J-B B.Amichot M.Cloning and expression of cytochrome P450 genes belonging to the CYP4 family and to a novelfamily，CYP48，in two hymenopteran insects，Trichogramma cacoeciae and Apis mellifera[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2000，268 （3）：677-682.

[24]Hung，Chien-Fu，Holzmacher.Conserved promoter elements in the CYP6B gene family suggest common ancestry for cytochrome P450 monooxygenases mediating furanocoumarin detoxification [J].ProcNatlAcad SciUSA，1996，93：12200-12205.

[25]Baudry J，Li W.Molecular docking of substrates and inhibitors in the catalytic site of CYP6B1，an insect cytochrome P450 monooxygenase [J].Protein Engineering，2003，16 （8）：577-587.

[26]Zhao Y，Halpert J R.Structure-function analysis of cytochromes P450 2B [J].Biochimica et Biophysica Acta，2007，1770（3）：402-412.

[27]Jonsson H，Schiedek D，et al.Protein responses in blue mussels（Mytilus edulis） exposed to organic pollutants：A combined CYP-antibody/proteomic approach [J].Aquatic Toxicology，2006，78（suppl 1）：49-56.

[28]Li X，Baudry J.Structural and functional divergence of insect CYP6B proteins：Fromspecialist togeneralist cytochrome P450[J].PNAS，2004，101（9）：2939-2944.

[29]Nelson D R.Cytochrome P450 and the individuality of species[J].Archives of Biochemistry and Biophysics，1999，369（1）：1-10.