金薄香核桃莖段初代培養(yǎng)的影響因素

牛 青，田建保，王國平

（1.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山西太原030006；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，山西太谷030815）

核桃（Juglans regia L.）屬胡桃科胡桃屬，是世界四大干果之一，有很高的經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和社會效益以及潛在的營養(yǎng)、保健和醫(yī)療價(jià)值，在世界各地廣泛栽培[1]。當(dāng)前，在農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和加入世貿(mào)組織的新形勢下，種植和發(fā)展核桃生產(chǎn)具有重要意義[2]。但作為異花授粉的果樹，核桃實(shí)生繁殖常易喪失優(yōu)良品種的特性，扦插又難以生根，嫁接繁殖也因接口處易發(fā)生褐變而成活率較低[3]。

組織培養(yǎng)以其快速繁殖苗木不受季節(jié)、時(shí)間、穗條數(shù)量限制和病蟲害的影響，以及可周年生產(chǎn)試管苗的顯著特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于各種花草、果樹苗木的培育[4]。同時(shí)，從遺傳角度講，利用組培技術(shù)還可得到高度一致、具有良好表現(xiàn)型的群體。

因此，20世紀(jì)60年代末，組織培養(yǎng)技術(shù)就已應(yīng)用于核桃的快速繁殖。國外主要有奇異核桃、北加州黑核桃、東部黑核桃及普通核桃的成年樹種組培快繁的報(bào)道[5]；而國內(nèi)側(cè)重于普通核桃組織培養(yǎng)的報(bào)道較多，如核桃組培離體繁殖技術(shù)在取材方面、控制外植體褐化、培養(yǎng)基組成及生根方面都有了很大進(jìn)展[6]，尤其是針對核桃的莖段、芽、葉片、胚、子葉等作為外植體都有培養(yǎng)成功的報(bào)道[7-9]。近年來，國外利用組織培養(yǎng)技術(shù)已開始進(jìn)行核桃優(yōu)良品種商業(yè)化生產(chǎn)。

金薄香核桃是山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所經(jīng)過近20 a的實(shí)生選育從新疆核桃中選育出的核桃優(yōu)良新品種。該品種具有早實(shí)、殼薄、出仁率高、取仁易、品質(zhì)優(yōu)、豐產(chǎn)、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)良特性[10]。

本試驗(yàn)以金薄香核桃為試驗(yàn)材料，利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行核桃莖段的快速繁殖，篩選出適合該品種組織培養(yǎng)的初代培養(yǎng)的最佳時(shí)間、最佳培養(yǎng)基及生長調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度的最佳配比，旨在為以后金薄香核桃的繼代培養(yǎng)及生根培養(yǎng)提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

金薄香核桃莖段初代培養(yǎng)所取外植體材料為金薄香核桃母株的枝條。試驗(yàn)在山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所進(jìn)行。

1.2 外植體材料的處理

將當(dāng)年生核桃枝條的葉片去掉，僅留0.5 cm的葉柄，保濕帶回實(shí)驗(yàn)室。先用洗潔精清洗1遍，然后用肥皂水清洗，再用自來水沖洗干凈。用解剖刀將枝條截成單芽莖段，放在無菌水中。在超凈工作臺上用無菌水沖洗2次后，將莖段置于75%乙醇中浸泡30 s，再用0.1%HgCl2消毒7～10 min，最后用無菌水沖洗4～5遍，用濾紙將表面水液吸干，切去莖段的兩頭部分，接種到培養(yǎng)基中[7]。

1.3 培養(yǎng)基的制作

試驗(yàn)采用的基本培養(yǎng)基分別為MS，DKW，WPM，同時(shí)附加不同種類和濃度的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，制成所需的培養(yǎng)基。各培養(yǎng)基均加入6 g/L瓊脂粉，用1 mol/L的NaOH或1 mol/L的HCl調(diào)pH值至5.8～6.0。所有配好的培養(yǎng)基經(jīng)高壓蒸汽滅菌18～20 min（120～125℃，1.2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓）?？股亟?jīng)過濾滅菌，再加入經(jīng)高溫滅菌的培養(yǎng)基中。

1.4 金薄香核桃莖段初培最佳時(shí)間的選擇

在金薄香核桃生長的季節(jié)（5月4日至9月12日），取當(dāng)年生莖段為外植體，每月取材1次，1月20日取經(jīng)過低溫處理的休眠枝條為外植體，共6個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)。每處理接種外植體50瓶，接種方式為豎直插入，每瓶1個(gè)莖段，培養(yǎng)基為MS＋6-BA2.0 mg/L＋I(xiàn)BA0.3 mg/L。接種3周后，統(tǒng)計(jì)污染率、褐化率、萌發(fā)率。

1.5 金薄香核桃莖段初培最佳培養(yǎng)基選擇試驗(yàn)

試驗(yàn)采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素及水平排列為：A.基本培養(yǎng)基為 MS（A1），DKW（A2），WPM（A3）；B.6-BA 質(zhì)量濃度為 0.5（B1），1.0（B2），2.0（B3）mg/L；C.IBA 質(zhì)量濃度為 0.1（C1），0.3（C2），0.5（C3）mg/L；D.庶糖質(zhì)量濃度為20（D1），30（D2），40（D3）g/L。共 9 個(gè)處理，每處理接種30瓶，每瓶1個(gè)莖段，重復(fù)2次。初代培養(yǎng)約20 d左右調(diào)查萌發(fā)率。

在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)條件為（26±2）℃，空氣相對濕度75%左右，光周期14 h/d，日光燈作為光源，光照強(qiáng)度2 000～3 500 lx。

2 結(jié)果與分析

2.1 金薄香核桃莖段初培最佳時(shí)間的選擇

對采自不同時(shí)期的外植體莖段進(jìn)行試驗(yàn)。從表1可以看出，不同生長季節(jié)的外植體莖段對初培的污染率、褐化率和萌發(fā)率有明顯的影響。造成污染的主要原因是霉菌污染和內(nèi)生菌污染。污染率隨著取材時(shí)間的推移而升高，主要是由內(nèi)生菌污染率的明顯提高造成的。而休眠枝的污染率明顯降低的原因是新抽生的枝條和5，6月份的枝條一樣，枝條內(nèi)部的內(nèi)生菌數(shù)量很少。褐化率在生長季節(jié)沒有明顯的區(qū)別。萌發(fā)率為5，6月份較高，分別為86.4%和85.1%，且隨著時(shí)間的推移，萌發(fā)率逐漸降低。而休眠枝的萌發(fā)率相對較高，這是因?yàn)樾菝咧Φ奈廴韭瘦^低的緣故。因此，生長季節(jié)核桃莖段的初代培養(yǎng)以5，6月份最好；經(jīng)過冬季低溫處理的休眠枝的初培效果也不錯(cuò)，只是枝條要經(jīng)過低溫處理并水培萌發(fā)，程序多，較麻煩。所以，生長季節(jié)的5，6月份做核桃的初代培養(yǎng)最好。

表1 不同取材時(shí)間對金薄香核桃初培中污染率、褐化率、萌發(fā)率影響的多重比較

2.2 金薄香核桃莖段初培最佳培養(yǎng)基選擇

由表2可知，最優(yōu)的組合是A3B3C2D2，即在WPM培養(yǎng)基中，添加6-BA2.0mg/L，IBA0.3 mg/L，蔗糖30 g/L，但這并沒有在本試驗(yàn)中反映出來；而從實(shí)際來看，最佳組合為處理2，即在MS培養(yǎng)基中，添加 6-BA 1.0 mg/L，IBA 0.3 mg/L，蔗糖30 g/L。因此，在進(jìn)一步的試驗(yàn)中，可以驗(yàn)證這2個(gè)培養(yǎng)基的優(yōu)劣。極差值越大，表示該因素越重要。表2顯示，4個(gè)因素中，IBA的極差最大，表明最重要的是IBA，其次依次是6-BA、基本培養(yǎng)基和蔗糖。

從表3可以看出，初代培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基的最優(yōu)組合是處理2，且它與其他組合相比，有顯著性差異。

表2 核桃初代培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基選擇

表3 核桃初代培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基的多重比較

3 討論和結(jié)論

在核桃的初代培養(yǎng)中，外植體的取材時(shí)間是初代培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。因?yàn)楹颂沂嵌嗄晟颈局参?，核桃枝條暴露在田間，菌類滋生，還有的細(xì)菌甚至滲透到組織內(nèi)部，因此，試驗(yàn)中外植體即使經(jīng)過細(xì)致的表面滅菌，仍然有污染情況出現(xiàn)。同時(shí)，外植體的褐變是初培失敗的主要原因。而外植體取材時(shí)間的不同，外植體的污染率和褐化率變化很大。本試驗(yàn)結(jié)果表明，外植體取材最佳時(shí)間是5—6月，此時(shí)污染率、褐化率相對較低，而萌發(fā)率有大幅度的提高。主要原因是此時(shí)采集的外植體材料生活力強(qiáng)，對外源激素敏感，反應(yīng)強(qiáng)，分化能力也較強(qiáng)。同時(shí)，初代培養(yǎng)基的選擇、外源生長調(diào)節(jié)劑的添加等也是促使外植體芽體萌發(fā)的主要影響因子。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，在MS培養(yǎng)基中，添加 6-BA 1.0 mg/L，IBA 0.3 mg/L，蔗糖30 g/L，外植體萌芽效果最好。

[1]王娟，田建保，賀小紅，等.“金薄香”核桃組培中滅菌及防止褐變的研究[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，28（3）：290-292.

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[6]劉淑蘭，韓碧文.核桃愈傷組織的誘導(dǎo)[J].植物生理學(xué)通訊，1984（4）：38.

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[8]曹孜義.實(shí)生植物組織培養(yǎng)技術(shù)教案[M].蘭州：甘肅科學(xué)技術(shù)出版社，1999.

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[10]田建保，陳秋芳，程恩明，等.核桃新品種：金薄香1號[J].山西果樹，2005（2）：3.