天津部分地區(qū)志賀菌臨床株血清分型及抗生素耐藥性分析

李艷芬，程玉謙，梁 帆，王 俊，祁 偉

（天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院感染科，天津市感染性疾病研究所，天津300211）

志賀菌所引起的細菌性痢疾是常見的腸道傳染病,隨著抗生素的廣泛應用，志賀菌的耐藥率正在逐年上升，嚴重威脅著人類健康。本研究對天津部分地區(qū)2009-2011年分離的志賀菌臨床株及本研究所保存的1981-1983年分離的志賀菌，進行血清分型及耐藥性分析，了解本地區(qū)志賀菌的血清分型和抗生素耐藥情況，分析其變化趨勢。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集天津地區(qū)多家三級甲等醫(yī)院2009-2011年腸道門診患者糞便標本的志賀菌154株，其中宋內(nèi)志賀菌140株，福氏志賀菌14株；1981-1983年由天津市感染性疾病研究所收集真空干燥低溫冷凍保存復活的30株志賀菌，其中福氏志賀菌29株，宋內(nèi)志賀菌1株。

1.2 試劑 福氏志賀菌診斷分型血清購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司；沙門氏菌-志賀氏菌瓊脂（SS）固體培養(yǎng)基購自杭州天和微生物試劑有限公司；水解酪蛋白（MH）瓊脂購自上海伊華生物科技有限公司。藥敏紙片包括氨芐西林、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢曲松、亞胺培南、四環(huán)素、鏈霉素、慶大霉素、阿米卡星、諾氟沙星、左氧氟沙星、復方磺胺甲惡唑（SMZco）共12種，購自北京天壇生物制品研究所。

1.3 方法

1.3.1 菌株分離、培養(yǎng)、鑒定 細菌培養(yǎng)根據(jù)臨床檢驗操作規(guī)程，將新鮮糞便標本接種于SS瓊脂上，經(jīng)37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h，挑取疑似志賀菌菌落，分純培養(yǎng)后進行生化鑒定。1981-1983年分離的30株志賀菌通過LB營養(yǎng)肉湯及血平皿復蘇存活并鑒定。

1.3.2 血清分型 采用玻片凝集法，生理鹽水作對照。

1.3.3 抗生素藥物敏感試驗 采用改良Kirby-Bauer紙片擴散法進行檢測，挑取培養(yǎng)18～24 h的單個菌落，稀釋至0.5麥氏濁度，用棉拭子涂布整個M-H培養(yǎng)基表面，貼抗生素紙片，放入35℃恒溫箱中，孵育18～24 h，所有菌株嚴格按照美國臨床和實驗室標準化研究所（CLSI/NCCLS）2010標準判斷及記錄結果。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對結果進行統(tǒng)計分析，采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 菌型分布 見表1。1981-1983年組30株志賀菌，其中福氏志賀菌29株，占96.67%，宋內(nèi)志賀菌1株，占3.33%；福氏志賀菌中血清1b型占58.62%（17/29），是數(shù)量最多的血清型，血清2a型占20.69%（6/29），血清 1a型占 13.79%（4/29），血清2b、4a型各分離出1株；而2009-2011年分離出的154株志賀菌中宋內(nèi)志賀菌140株，占90.91%，福氏志賀菌14株，僅占9.09%，血清分型較分散，未發(fā)現(xiàn)血清1b、4a型，出現(xiàn)了新的血清型5b、X變種及Y變種。

表1 福氏志賀菌血清分型（n）Tab 1 Serotypesof Shigella flexneri（n）

2.2 耐藥性檢測 結果見表2。因1981-1983年分離的宋內(nèi)志賀菌僅有1株，此次藥敏分析不包括在內(nèi)。

表2 不同時期志賀菌藥敏試驗結果比較[n(%)]Tab2 Com parison of antim icrobial resistance rates in different years[n(%)]

2.2.1 2009-2011年組志賀菌耐藥性比較 不同志賀菌的耐藥性不一致，福氏志賀菌對頭孢噻肟、頭孢曲松、諾氟沙星的耐藥率高于宋內(nèi)志賀菌（P<0.05），對慶大霉素的耐藥率低于宋內(nèi)志賀菌（P<0.05），兩者對氨芐西林、四環(huán)素、鏈霉素、復方磺胺甲惡唑的耐藥率均較高，已達80%以上，而對頭孢他啶、阿米卡星、左氧氟沙星的耐藥率較低。福氏志賀菌對四環(huán)素、鏈霉素的耐藥率均較高，而對頭孢他啶、亞胺培南、阿米卡星、喹諾酮類的耐藥率較低；其中，福氏2b、4a、X變種、Y變種對三代頭孢、亞胺培南、慶大霉素、阿米卡星、諾氟沙星均敏感。

2.2.2 不同時期福氏志賀菌耐藥性比較 1981-1983年組福氏志賀菌對四環(huán)素的耐藥率最高，為93.10%，其次是鏈霉素、復方磺胺甲惡唑，分別為72.41%、31.03%，對氨芐西林、慶大霉素的耐藥率均低于20%，未發(fā)現(xiàn)三代頭孢、亞胺培南、阿米卡星及喹諾酮類藥物耐藥菌株；而2009-2011年組福氏志賀菌對鏈霉素的耐藥率為100%，其次是四環(huán)素、氨芐西林、復方磺胺甲惡唑，分別為92.86%、85.71%、85.71%，對三代頭孢等其他藥物耐藥率均低于30%，未發(fā)現(xiàn)亞胺培南及阿米卡星耐藥菌株。

2.2.3 多重耐藥性 1981-1983年分離的志賀菌中3種及3種以上抗生素多重耐藥菌為9株，占31.03%，而2009-2011年分離的志賀菌中多重耐藥菌為148株，占96.10%，明顯高于1981-1983年組，且差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

3 討論

志賀菌是引起細菌性痢疾的主要病原菌，世界各地的志賀菌群每隔20～30年會發(fā)生一次明顯的變遷，各血清型之間也存在演化,在原有血清型的基礎上進化出更能適應環(huán)境改變的新亞型[1]，但總的來說，發(fā)達國家以宋內(nèi)志賀菌占優(yōu)勢，發(fā)展中國家以福氏志賀菌為主[2]。2009年我國細菌性痢疾檢測分析結果顯示，福氏志賀菌仍為最常見菌種，占67.26%，其次為宋內(nèi)志賀菌（32.74%），但存在地區(qū)差異性，貴州、福建、北京的優(yōu)勢菌群已轉變?yōu)樗蝺?nèi)志賀菌[3]。不同地區(qū)福氏志賀菌的流行血清型不同[4-5]，同一地區(qū)不同年份的優(yōu)勢血清型也不相同[6-7]。本試驗對比研究了1981-1983年組和2009-2011年組志賀菌的血清分型，發(fā)現(xiàn)在1981-1983年分離的30株志賀菌中，福氏志賀菌占96.67%，其中血清1b型有17株，為優(yōu)勢血清型?；仡櫛狙芯抠Y料，1990年7-10月間檢出的73株志賀菌中宋內(nèi)志賀菌（52.0%）比例略高于福氏志賀菌（45.3%），既往1996年檢出33株志賀菌中福氏志賀菌27株，占81.82%，宋內(nèi)志賀菌僅有3株（9.09%）[8-9]。而2009-2011年分離的154株志賀菌中，福氏志賀菌僅占9.09%，宋內(nèi)志賀菌占了90.91%，成為近幾年來的優(yōu)勢菌，這與國內(nèi)其他地區(qū)的報道類似[3]；未發(fā)現(xiàn)血清1b型，其它血清型分布也與1981-1983年組有明顯差異，福氏2a型數(shù)量最多，并且出現(xiàn)了1981-1983年組未發(fā)現(xiàn)的血清型5b、X變種及Y變種，呈多樣化趨勢。由此可見，天津部分地區(qū)志賀菌血清型分布隨著時間變遷發(fā)生了明顯變化，優(yōu)勢血清型也隨之改變，因此加強對志賀菌的監(jiān)測工作，注意新菌型的出現(xiàn)，了解菌型的變化趨勢，對細菌性痢疾的防控工作及流行病學調查具有重要意義。

由于近年抗生素的過度使用，志賀菌耐藥菌株呈現(xiàn)逐漸加重的趨勢，并產(chǎn)生多重耐藥。本試驗研究不同時期分離的兩組志賀菌發(fā)現(xiàn)，相較于1981-1983年組福氏志賀菌，2009-2011年分離的福氏志賀菌不但大多數(shù)亞型已出現(xiàn)耐藥菌，而且除亞胺培南、阿米卡星、四環(huán)素外，對其他藥物的耐藥率均有不同程度的升高，其中氨芐西林耐藥率的增長最嚴重，由17.24%增長至85.71%，其次是復方磺胺甲惡唑（31.03%～85.71%）；福氏志賀菌與宋內(nèi)志賀菌對多種抗生素的耐藥率也存在明顯差異，且均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。本文結果顯示阿米卡星對志賀菌屬在體外仍具有一定的抗菌活性，但根據(jù)CLSI的研究，氨基糖苷類藥物即使體外有活性，但臨床無效，因此治療細菌性痢疾應注意合理用藥。所檢測菌株藥敏結果還顯示5種及5種以上抗生素多重耐藥菌株也由1981-1983年組的0上升至2009-2011年組的 11.69%（P<0.05）。2009-2011年分離的志賀菌臨床株對復方磺胺甲惡唑、氨芐西林、頭孢噻肟、頭孢曲松的耐藥率均高于國外報道[10]。由于保存條件等因素的影響，本試驗1981-1983年組的志賀菌株數(shù)量較少，進一步確切研究還需增加樣本量。

綜上所述，天津市部分地區(qū)志賀菌的優(yōu)勢菌型隨時間改變已發(fā)生了變化，耐藥性也隨之改變，耐藥菌比例不斷升高，多重耐藥情況嚴峻，因此臨床治療中必須嚴格掌握抗生素應用指征，防止耐藥情況的繼續(xù)惡化。

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