中藥分析技術(shù)領(lǐng)域研究前沿及發(fā)展趨勢(shì)

王書芳，程翼宇

(浙江大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州 310058)

中藥化學(xué)物質(zhì)組成十分復(fù)雜，中藥產(chǎn)品藥效物質(zhì)及其作用機(jī)制不明確是制約中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸?，F(xiàn)代儀器分析技術(shù)的快速發(fā)展不僅為中藥研究提供了機(jī)遇和新的方法，而且為實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化開辟了技術(shù)途徑，推動(dòng)了中藥研究領(lǐng)域的學(xué)術(shù)創(chuàng)新和技術(shù)的跨越式發(fā)展。

1 中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究領(lǐng)域

辨析中藥化學(xué)物質(zhì)組成是中藥現(xiàn)代化研究的基礎(chǔ)，也是研究中藥藥效物質(zhì)及其作用機(jī)制的主要切入點(diǎn)。中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究的傳統(tǒng)方法是采用提取、萃取、柱層析或制備型液相色譜等手段獲得中藥所含的單體化合物，進(jìn)而用核磁共振或紅外光譜等儀器鑒定化合物的結(jié)構(gòu)。然而，這類分離分析方法耗時(shí)耗力、效率低下，當(dāng)中藥成分微量時(shí)難以得到足量化合物用于鑒定結(jié)構(gòu)，而中藥，特別是中藥方劑往往含有近百種甚至幾百種以上的微量成分。因此，色譜-質(zhì)譜聯(lián)用及液相色譜-核磁共振聯(lián)用(LC-NMR)等快速鑒定方法應(yīng)運(yùn)而生，其為辨析復(fù)雜中藥的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)提供了先進(jìn)手段。中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究的新技術(shù)還有二維色譜和擴(kuò)散排序核磁共振法。

1.1 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù) 常用的色-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)包括氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)，其特點(diǎn)是將色譜高效分離能力與質(zhì)譜的結(jié)構(gòu)鑒定能力相結(jié)合，可快速分辨中藥化學(xué)物質(zhì)。GC-MS從上世紀(jì)60年代發(fā)展至今，技術(shù)方法相當(dāng)成熟，NIST質(zhì)譜庫已收錄了147 000余種化合物的質(zhì)譜圖。根據(jù)GC-MS分析數(shù)據(jù)可從庫中搜索匹配相應(yīng)的化合物結(jié)構(gòu)，該技術(shù)常用于定性分析中藥的揮發(fā)性成分或經(jīng)衍生化后可揮發(fā)的成分;近年出現(xiàn)的氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用(GC-TOF-MS)技術(shù)，能提供化合物的準(zhǔn)確分子量，使結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果更加可靠。LC-MS分析技術(shù)始于上世紀(jì)70年代，常用于中藥的不揮發(fā)性或熱不穩(wěn)定成分分析，其分離效率雖比GC低，但適用對(duì)象更廣，是目前發(fā)展最為迅速的色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法。這類技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)是液相色譜與復(fù)合型質(zhì)譜聯(lián)用，如四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜(Q-TOFMS)［1］、四級(jí)桿-線性離子阱質(zhì)譜(Qtrap-MS)［2］、離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜 (IT-TOFMS)［3］、線性離子阱-靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜(LTQOrbitrap-MS)［4］、線性離子阱-傅立葉變換-離子回旋共振質(zhì)譜(LTQ-FT-ICR-MS)等。這些復(fù)合型質(zhì)譜將不同類型的質(zhì)譜串聯(lián)起來，以提高分辨率、檢測(cè)靈敏度及質(zhì)量測(cè)定準(zhǔn)確度等，或者增強(qiáng)其定量能力，在一臺(tái)質(zhì)譜儀上實(shí)現(xiàn)定量和定性分析。超高效液相色譜(UPLC/UHPLC)或快速分離液相色譜(RRLC)是近年發(fā)展起來的新技術(shù)，比普通HPLC的分離效率和檢測(cè)靈敏度更高，分析速度更快，其較低的流速使得質(zhì)譜離子化效率提高、基質(zhì)效應(yīng)降低，與質(zhì)譜聯(lián)用優(yōu)勢(shì)明顯［3］。

1.2 二維色譜技術(shù) 對(duì)于化學(xué)組成復(fù)雜、類別差異大的中藥，僅用一種分離方法往往不易分離。二維色譜將兩種不同的分離方法聯(lián)用，以提高其分離力、增加色譜的峰容量。Wu等［5］建立了用陽離子交換色譜與反相加壓毛細(xì)管電色譜結(jié)合的二維分離平臺(tái)，采用三種分離原理分析了中藥材黃柏。

1.3 LC-NMR和LC-NMR-MS技術(shù) 在確定化合物結(jié)構(gòu)的定性分析方法中，核磁共振譜(NMR)是最強(qiáng)的化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定技術(shù)之一，但是其靈敏度較低，實(shí)現(xiàn)LC-NMR定性分析的難度較大，不僅LC洗脫液對(duì)NMR測(cè)定有影響，而且LC流速快，與NMR測(cè)定所需時(shí)間難以匹配。而傅立葉變換核磁共振儀和脈沖序列的發(fā)展為解決上述問題提供了可能。由于NMR對(duì)13C的靈敏度很低，目前的 LC-NMR只能作1H NMR，一般通過檢測(cè)與13C相連的1H來檢測(cè)13C，這樣一部分重要的化合物結(jié)構(gòu)信息會(huì)由此缺損。另外，采用溶劑信號(hào)抑制技術(shù)雖可抑制溶劑信號(hào)，但若待測(cè)化合物的信號(hào)恰好與溶劑峰重疊，則將導(dǎo)致部分結(jié)構(gòu)信息丟失;并且在此條件下測(cè)得的化合物的化學(xué)位移與在標(biāo)準(zhǔn)氘代試劑下測(cè)定的化學(xué)位移有一定的偏差。

盡管LC-NMR目前仍有較大問題需要克服，但它是中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究領(lǐng)域技術(shù)發(fā)展的前沿方向，現(xiàn)已出現(xiàn)商品化 LC-NMR和 LCNMR-MS儀器。采用 LC-NMR［6］和 LC-NMRMS［7］對(duì)中草藥化學(xué)成分進(jìn)行分離鑒定已見報(bào)道。為解決LC-NMR靈敏度低的缺點(diǎn)，可采用在線固相萃取(SPE)裝置使待測(cè)成分得到濃集，多次進(jìn)樣后能獲得足夠的樣品量。Clarkson等人［8］使用 HPLC-SPE-NMR研究了植物Kanahia laniflora中的黃酮類和強(qiáng)心苷類成分。

1.4 擴(kuò)散排序核磁共振技術(shù)(DOSY) 該技術(shù)是利用混合物溶液中不同化學(xué)成分一般具有不同擴(kuò)散系數(shù)的物理特性，用核磁共振脈沖梯度場(chǎng)法不分離分析混合物中化學(xué)成分結(jié)構(gòu)［9］。該技術(shù)省時(shí)省力，尤其適用于定性分析在分離過程中易發(fā)生變化的化學(xué)成分。

2 中藥質(zhì)量分析研究領(lǐng)域

2.1 中藥有效成分分析技術(shù)檢測(cè) 中藥有效成分常使用GC、LC、毛細(xì)管電泳(CE)等色譜分離法，配以紫外(UV)、蒸發(fā)光散射(ELSD)、質(zhì)譜、脈沖安培(PAD)、熒光(FLD)、氮化學(xué)發(fā)光(CLND)［10］或電霧式(CAD)［11］等不同的檢測(cè)器，其中UV、ELSD及MS檢測(cè)器應(yīng)用較多;MS、PAD、FLD和CLND為高靈敏度檢測(cè)器，而MS、ELSD和CAD為通用型檢測(cè)器，特別適用于檢測(cè)無紫外吸收或紫外吸收較弱的化合物。美國ESA公司于2003年推出的CAD檢測(cè)器，靈敏度是ELSD的10倍左右，且線性范圍寬，在中藥分析中有很好的應(yīng)用前景。

定量核磁共振(qNMR)具有無需對(duì)照品，樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單，定量準(zhǔn)確等特點(diǎn)。在某些中藥成分的測(cè)定中有著獨(dú)特優(yōu)勢(shì)［12］。

2.2 中藥指紋圖譜分析技術(shù) 化學(xué)指紋圖譜能表征中藥復(fù)雜成分的整體特征，已被 WHO、美國FDA和我國SFDA等藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)采納并用于植物藥或中藥質(zhì)量檢驗(yàn)，許多研究者將其用于中藥質(zhì)量控制。目前，化學(xué)指紋圖譜研究以HPLC為主，GC和CE等其它指紋圖譜研究報(bào)道較少。當(dāng)中藥化學(xué)物質(zhì)組成十分復(fù)雜，含有多類理化性質(zhì)差異較大的成分時(shí)，使用單一化學(xué)指紋圖譜難以涵蓋中藥物質(zhì)體系的整體化學(xué)信息。LC、GC和CE所檢測(cè)的化學(xué)成分不同，分析信息可互補(bǔ)。為全面表征中藥化學(xué)組成，多源指紋圖譜分析技術(shù)成為發(fā)展方向。多源色譜指紋圖譜一般采用不同的檢測(cè)器同時(shí)檢測(cè)有紫外吸收和無紫外吸收成分，如LC-UVELSD、LC-UV-MS等。LC指紋圖譜與多指標(biāo)成分含量測(cè)定相結(jié)合的定量指紋圖譜能更準(zhǔn)確的表達(dá)中藥整體信息［13］。此外，中藥譜效關(guān)系研究［14］為制定基于藥效的中藥產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了新思路。

2.3 中藥有毒有害成分分析技術(shù) 中藥在種植、貯存和制造等過程中會(huì)受到農(nóng)藥、重金屬和真菌毒素等有毒有害物質(zhì)污染，因此急需建立快速、靈敏、專屬的檢測(cè)方法來監(jiān)管。檢測(cè)中藥中有害殘留物屬痕量或超痕量分析，對(duì)儀器分析技術(shù)要求很高。目前主要采用 GC-MS或LC-MS檢測(cè)中藥有毒有害成分，毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用(CE-MS)檢測(cè)法也有少量報(bào)道。由于中藥基質(zhì)復(fù)雜，樣品預(yù)處理是檢測(cè)有害殘留物的關(guān)鍵步驟之一，研究適合于不同類型中藥基質(zhì)的樣品預(yù)處理方法十分重要［15］。在2010版《中國藥典》中，真菌毒素的檢測(cè)方法為 LCFLD，但已有越來越多的報(bào)道使用 LC-MS［16］。LC-MS專屬性高、假陽性率低，今后可能會(huì)取代LC-FLD法。檢測(cè)重金屬的常用方法包括分光光度法、原子吸收光譜法、原子發(fā)射光譜法、熒光分析法等，但大多只能單個(gè)元素測(cè)定。新的電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)可同時(shí)測(cè)定多個(gè)成分，且檢出限更低［17］。

隨著龍膽瀉肝丸、關(guān)木通等個(gè)別中藥藥害事件的發(fā)生，中藥安全性越來越受到公眾關(guān)注，中藥毒性成分檢測(cè)已成為中藥質(zhì)量控制技術(shù)研究的重要方面［18］。

3 中藥藥效物質(zhì)及其作用機(jī)制研究領(lǐng)域

3.1 中藥藥效物質(zhì)篩選技術(shù) 生物色譜法出現(xiàn)于20世紀(jì)80年代中后期，它將藥效成分的分離與篩選相結(jié)合，克服了中藥分離分析的盲目性。親和超濾是近年來發(fā)展的一種篩選技術(shù)，具有親和層析的高選擇性和超濾處理樣本快速等優(yōu)點(diǎn)，Choi等［19］將超濾篩選與 LC-MS檢測(cè)結(jié)合，可快速篩選出作用于QR-2的活性物質(zhì)。Yasuda［20］將SIRT6酶結(jié)合在磁珠上，用于從葫蘆巴提取物中篩選治療低血糖及衰老相關(guān)疾病的活性物質(zhì)。

3.2 中藥作用機(jī)制的組學(xué)分析技術(shù) 中藥的組學(xué)研究包括基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及代謝組學(xué)等?；蛐酒?1］是最主流的組學(xué)分析技術(shù)，常用的蛋白質(zhì)組學(xué)分析有二維電泳(2-DE)、熒光差異二維電泳技術(shù)(DIGE)、蛋白質(zhì)芯片和LC-MS 技術(shù)等，代謝組學(xué)分析包括 NMR［22］、GC-MS［23］、LC-MS 以及 CE-MS 等技術(shù)。UPLCQ-TOF-MS［24］因其性能優(yōu)越，得到了研究者的青睞。

4 中藥體內(nèi)過程及藥代動(dòng)力學(xué)研究領(lǐng)域

中藥體內(nèi)過程分析及藥代動(dòng)力學(xué)研究對(duì)于闡明中藥作用機(jī)制及指導(dǎo)中藥臨床合理用藥有十分重要的意義。由于中藥藥效成分往往含量很低，體內(nèi)濃度甚微，基質(zhì)復(fù)雜，導(dǎo)致中藥體內(nèi)分析難度很大，要求分析方法具有較高的靈敏度及選擇性。LC-MS/MS可通過選擇反應(yīng)檢測(cè)(SRM)或多反應(yīng)檢測(cè)(MRM)等模式消除背景干擾，提高靈敏度，是中藥體內(nèi)分析的最主要技術(shù)［25-26］。

5 中藥制藥過程質(zhì)量控制研究領(lǐng)域

過程分析技術(shù)(PAT)由美國政府FDA倡導(dǎo)。該技術(shù)是通過對(duì)整個(gè)制藥過程進(jìn)行分析，深刻了解制藥過程原理，實(shí)施制藥過程質(zhì)量控制，建立科學(xué)嚴(yán)格的藥品質(zhì)量保障體系。近紅外光譜是醫(yī)藥工業(yè)最為常用的在線檢測(cè)設(shè)備，也是PAT在中藥制藥產(chǎn)業(yè)應(yīng)用研究的熱點(diǎn)。近紅外光譜已用于鑒別藥材來源［27］、測(cè)定中藥的主要成分含量［28］，以及在線檢測(cè)中藥生產(chǎn)過程的質(zhì)量指標(biāo)［29］等。

6 總結(jié)與展望

以{主題 =(“chinese medicine”or(herb*not herbicide)or botanical)AND出版類型=(Article)}進(jìn)行搜索，近5年關(guān)于中藥或植物藥研究的SCI收錄文獻(xiàn)量為34 240篇，年平均增幅約為500篇，表明中藥及天然藥物已吸引越來越多的研究者;對(duì)論文作者所在國的統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，美國、中國和德國是該領(lǐng)域發(fā)表論文數(shù)量的前三強(qiáng)，美國最多，中國緊隨其后。中藥分析方面的大部分論文采用HPLC方法，而LC-MS已成為主流技術(shù);CE雖在分離效率和分析速度上有諸多優(yōu)勢(shì)，但在中藥分析中應(yīng)用仍較少;UPLC/RRLC作為一種新技術(shù)尚未推廣普及。

在未來若干年，聚焦于中藥質(zhì)量檢驗(yàn)、中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、現(xiàn)代中藥創(chuàng)制等重點(diǎn)應(yīng)用領(lǐng)域，中藥分析技術(shù)將得到創(chuàng)新發(fā)展，其主要趨勢(shì)為:在中藥質(zhì)量檢驗(yàn)方面，LC-復(fù)合型質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)將得到更多應(yīng)用，多源化學(xué)指紋圖譜研究將取得新突破;中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究方面涌現(xiàn)出一些新的篩選-分析集成技術(shù)，高分辨核磁共振技術(shù)得到有效應(yīng)用;組學(xué)分析技術(shù)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及多元藥理學(xué)相結(jié)合，可望揭示中藥多組分多靶點(diǎn)整合調(diào)節(jié)機(jī)制，并為創(chuàng)制基于網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)的多靶點(diǎn)新藥提供技術(shù)手段。

［1］CHENG X，WAN J，LI P，et al.Ultrasonic/microwave assisted extraction and diagnostic ion filtering strategy by liquid chromatographyquadrupole time-of-flight mass spectrometry for rapid characterization of flavonoids in Spatholobus suberectus［J］.Journal of Chromatography A，2011，1218(34):5774-5786.

［2］SHEN Y，HAN C，JIANG Y，et al.Rapid quantification of four major bioactive alkaloids in Corydalis decumbens (Thunb.) Pers. by pressurised liquid extraction combined with liquid chromatography-triple quadrupole linear ion trap mass spectrometry ［J］.Talanta，2011，84(4):1026-1031.

［3］CAO G，ZHANG C，ZHANG Y，et al.Global detection and identification of components from crude and processed traditional Chinese medicine by liquid chromatography connected with hybrid ion trap and time-of-flight-mass spectrometry ［J］.Journal of Separation Science，2011，34(15):1845-1852.

［4］PENG J B，JIA H M，LIU Y T，et al.Qualitative and quantitative characterization of chemical constituents in Xin-Ke-Shu preparations by liquid chromatography coupled with a LTQ Orbitrap mass spectrometer［J］.J Pharm Biomed Anal，2011，55(5):984-995.

［5］WU Y，WANG Y，GU X，et al.Two-dimensional strong cation-exchange liquid chromatography/reversed-phase pressurized capillary electrochromatography for separation of complex samples［J］.Journal of Separation Science，2011，34(9):1027-1034.

［6］DIAS D A，URBAN S.Phytochemical studies of the southern Australian marine alga，Laurencia elata［J］.Phytochemistry，2011，72(16):2081-2089.

［7］KANG S W，Kim C Y，SONG D G，et al.Rapid identification of furanocoumarins in Angelica dahurica using the online LC-MMR-MS and their nitric oxide inhibitory activity in RAW 264.7 cells［J］.Phytochemical Analysis，2010，21(4):322-327.

［8］CLARKSON C，STAERK D，HANSEN S H，et al.Hyphenation of solid-phase extraction with liquid chromatography and nuclear magnetic resonance:application of HPLC-DAD-SPE-NMR to identification of constituents of Kanahia laniflora［J］.Analytical Chemistry，2005，77(11):3547-3553.

［9］VAYSSE J，BALAYSSAC S，GILARD V，et al.Analysis of adulterated herbal medicines and dietary supplements marketed for weight loss by DOSY1HNMR ［J］.Food Additives and Contaminants:Part A，2010，27(7):903-916.

［10］SUN J，GUO H，SEMIN D，et al.Direct separation and detection of biogenic amines by ion-pair liquid chromatography with chemiluminescent nitrogen detector［J］.Journal of Chromatography A，2011，1218(29):4689-4697.

［11］BAI C C，HAN S Y，CHAI X Y，et al.Sensitive determination of saponins in radix et rhizoma notoginseng by charged aerosol detector coupled with HPLC ［J］. Journal of Liquid Chromatography ＆ Related Technologies，2009，32(2):242-260.

［12］LIU N Q，CHOI Y H，VERPOORTE R，et al.Comparative quantitative analysis of artemisinin by chromatography and qNMR ［J］.Phytochemical Analysis，2010，21(5):451-456.

［13］YANG D，AN T Q，JIANG X，et al.Development of a novel method combining HPLC fingerprint and multi-ingredients quantitative analysis for quality evaluation of traditional chinese medicine preparation ［J］.Talanta，2011，85(2):885-890.

［14］BOYLE S P，DOOLAN P J，ANDREWS C E，et al.Evaluation of quality control strategies in Scutellaria herbal medicines［J］.Journal of Pharmaceutical And Biomedical Analysis，2011，54(5):951-957.

［15］LI X，WANG L，WANG Z，et al.Ultrasonic nebulization extraction coupled with headspace hollow fiber microextraction of pesticides from root of Panax ginseng C.A.Mey ［J］.Journal of Separation Science，2011，34(13):1582-1589.

［16］HAN Z，ZHENG Y，LUAN L，et al.An ultra-highperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for simultaneous determination of aflatoxins B1，B2，G1，G2，M1 and M2 in traditional Chinese medicines ［J］.Analytica Chimica Acta，2010，664(2):165-171.

［17］KOU X M，XU M，GU Y Z.Determination of trace heavy metal elements in cortex phellodendri chinensis by ICP-MS after microwave-assisted digestion ［J］.Spectroscopy and Spectral Analysis，2007，27(6):1197-1200.

［18］HEATON J，WHILEY L，HONG Y，et al.Evaluation of Chinese medicinal herbs fingerprinting by HPLC-DAD for the detection of toxic aristolochic acids ［J］.Journal of Separation Science，2011，34(10):1111-1115.

［19］CHOI Y，JERMIHOV K，NAM S，et al.Screening natural products for inhibitors of quinone reductase-2 using ultrafiltration LC-MS ［J］.Analytical Chemistry，2011，83(3):1048-1052.

［20］YASUDA M，WILSON D R，F(xiàn)UGMANN S D，et al.Synthesis and characterization of SIRT6 protein coated magnetic beads:identification of a novel inhibitor of SIRT6 deacetylase from medicinal plant extracts［J］.Analytical Chemistry，2011，83(19):7400-7407.

［21］WEN Z，WANG Z，WANG S，et al.Discovery of molecular mechanisms of traditional Chinese medicinal formula Si-Wu-Tang using gene expression microarray and connectivity map［J］.PLoS ONE，2011，6(3):e18278.

［22］ZHOU Y，LU L，LI Z，et al.Antidepressant-like effects of the fractions of Xiaoyaosan on rat model of chronic unpredictable mild stress［J］.Journal of Ethnopharmacology，2011，137(1):236-244.

［23］LI X，LUO X，LU X，et al.Metabolomics study of diabetic retinopathy using gas chromatographymass spectrometry:a comparison of stages and subtypes diagnosed by Western and Chinesemedicine ［J］.Molecular Biosystems，2011，7(7):2228-2237.

［24］LIU S，LU F，WANG X，et al.Metabolomic study of a rat fever model induced with 2，4-dinitrophenol and the therapeutic effects of a crude drug derived from coptis chinensis［J］.American Journal of Chinese Medicine，2011，39(1):95-109.

［25］XIA Y，WEI G，SI D，et al.Quantitation of ursolic acid in human plasma by ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry and its pharmacokinetic study ［J］. Journal of Chromatography B，2011，879(2):219-224.

［26］ZHENG X，XU L，LIANG Y，et al.Quantitative determination and pharmacokinetic study of solamargine in rat plasma by liquid chromatography-mass spectrometry［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2011，55(5):1157-1162.

［27］LAI Y，NI Y，KOKOT S.Discrimination of Rhizoma Corydalis from two sources by nearinfrared spectroscopy supported by the wavelet transform and least-squares support vector machine methods［J］.Vibrational Spectroscopy，2011，56(2):154-160.

［28］LAU C C，CHAN C O，CHAU F T，et al.Rapid analysis of Radix puerariae by near-infrared spectroscopy［J］.Journal of Chromatography A，2009，1216(11):2130-2135.

［29］HUANG H，QU H.In-line monitoring of alcohol precipitation by near-infrared spectroscopy in conjunction with multivariate batch modeling［J］.Analytica Chimica Acta，2011，707(1-2):47-56.