中藥分析技術領域研究前沿及發(fā)展趨勢

王書芳，程翼宇

(浙江大學藥學院，浙江杭州 310058)

中藥化學物質組成十分復雜，中藥產(chǎn)品藥效物質及其作用機制不明確是制約中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。現(xiàn)代儀器分析技術的快速發(fā)展不僅為中藥研究提供了機遇和新的方法，而且為實現(xiàn)中藥現(xiàn)代化開辟了技術途徑，推動了中藥研究領域的學術創(chuàng)新和技術的跨越式發(fā)展。

1 中藥物質基礎研究領域

辨析中藥化學物質組成是中藥現(xiàn)代化研究的基礎，也是研究中藥藥效物質及其作用機制的主要切入點。中藥物質基礎研究的傳統(tǒng)方法是采用提取、萃取、柱層析或制備型液相色譜等手段獲得中藥所含的單體化合物，進而用核磁共振或紅外光譜等儀器鑒定化合物的結構。然而，這類分離分析方法耗時耗力、效率低下，當中藥成分微量時難以得到足量化合物用于鑒定結構，而中藥，特別是中藥方劑往往含有近百種甚至幾百種以上的微量成分。因此，色譜-質譜聯(lián)用及液相色譜-核磁共振聯(lián)用(LC-NMR)等快速鑒定方法應運而生，其為辨析復雜中藥的化學物質基礎提供了先進手段。中藥物質基礎研究的新技術還有二維色譜和擴散排序核磁共振法。

1.1 色譜-質譜聯(lián)用技術 常用的色-質聯(lián)用技術包括氣相色譜-質譜聯(lián)用(GC-MS)和液相色譜-質譜聯(lián)用(LC-MS)，其特點是將色譜高效分離能力與質譜的結構鑒定能力相結合，可快速分辨中藥化學物質。GC-MS從上世紀60年代發(fā)展至今，技術方法相當成熟，NIST質譜庫已收錄了147 000余種化合物的質譜圖。根據(jù)GC-MS分析數(shù)據(jù)可從庫中搜索匹配相應的化合物結構，該技術常用于定性分析中藥的揮發(fā)性成分或經(jīng)衍生化后可揮發(fā)的成分;近年出現(xiàn)的氣相色譜-飛行時間質譜聯(lián)用(GC-TOF-MS)技術，能提供化合物的準確分子量，使結構鑒定結果更加可靠。LC-MS分析技術始于上世紀70年代，常用于中藥的不揮發(fā)性或熱不穩(wěn)定成分分析，其分離效率雖比GC低，但適用對象更廣，是目前發(fā)展最為迅速的色譜-質譜聯(lián)用分析方法。這類技術的發(fā)展趨勢是液相色譜與復合型質譜聯(lián)用，如四級桿-飛行時間質譜(Q-TOFMS)、四級桿-線性離子阱質譜(Qtrap-MS)、離子阱-飛行時間質譜 (IT-TOFMS)、線性離子阱-靜電場軌道阱質譜(LTQOrbitrap-MS)、線性離子阱-傅立葉變換-離子回旋共振質譜(LTQ-FT-ICR-MS)等。這些復合型質譜將不同類型的質譜串聯(lián)起來，以提高分辨率、檢測靈敏度及質量測定準確度等，或者增強其定量能力，在一臺質譜儀上實現(xiàn)定量和定性分析。超高效液相色譜(UPLC/UHPLC)或快速分離液相色譜(RRLC)是近年發(fā)展起來的新技術，比普通HPLC的分離效率和檢測靈敏度更高，分析速度更快，其較低的流速使得質譜離子化效率提高、基質效應降低，與質譜聯(lián)用優(yōu)勢明顯。

1.2 二維色譜技術 對于化學組成復雜、類別差異大的中藥，僅用一種分離方法往往不易分離。二維色譜將兩種不同的分離方法聯(lián)用，以提高其分離力、增加色譜的峰容量。Wu等建立了用陽離子交換色譜與反相加壓毛細管電色譜結合的二維分離平臺，采用三種分離原理分析了中藥材黃柏。

1.3 LC-NMR和LC-NMR-MS技術 在確定化合物結構的定性分析方法中，核磁共振譜(NMR)是最強的化學結構鑒定技術之一，但是其靈敏度較低，實現(xiàn)LC-NMR定性分析的難度較大，不僅LC洗脫液對NMR測定有影響，而且LC流速快，與NMR測定所需時間難以匹配。而傅立葉變換核磁共振儀和脈沖序列的發(fā)展為解決上述問題提供了可能。由于NMR對C的靈敏度很低，目前的 LC-NMR只能作H NMR，一般通過檢測與C相連的H來檢測C，這樣一部分重要的化合物結構信息會由此缺損。另外，采用溶劑信號抑制技術雖可抑制溶劑信號，但若待測化合物的信號恰好與溶劑峰重疊，則將導致部分結構信息丟失;并且在此條件下測得的化合物的化學位移與在標準氘代試劑下測定的化學位移有一定的偏差。

盡管LC-NMR目前仍有較大問題需要克服，但它是中藥物質基礎研究領域技術發(fā)展的前沿方向，現(xiàn)已出現(xiàn)商品化 LC-NMR和 LCNMR-MS儀器。采用 LC-NMR和 LC-NMRMS對中草藥化學成分進行分離鑒定已見報道。為解決LC-NMR靈敏度低的缺點，可采用在線固相萃取(SPE)裝置使待測成分得到濃集，多次進樣后能獲得足夠的樣品量。Clarkson等人使用 HPLC-SPE-NMR研究了植物Kanahia laniflora中的黃酮類和強心苷類成分。

1.4 擴散排序核磁共振技術(DOSY) 該技術是利用混合物溶液中不同化學成分一般具有不同擴散系數(shù)的物理特性，用核磁共振脈沖梯度場法不分離分析混合物中化學成分結構。該技術省時省力，尤其適用于定性分析在分離過程中易發(fā)生變化的化學成分。

2 中藥質量分析研究領域

2.1 中藥有效成分分析技術檢測 中藥有效成分常使用GC、LC、毛細管電泳(CE)等色譜分離法，配以紫外(UV)、蒸發(fā)光散射(ELSD)、質譜、脈沖安培(PAD)、熒光(FLD)、氮化學發(fā)光(CLND)或電霧式(CAD)等不同的檢測器，其中UV、ELSD及MS檢測器應用較多;MS、PAD、FLD和CLND為高靈敏度檢測器，而MS、ELSD和CAD為通用型檢測器，特別適用于檢測無紫外吸收或紫外吸收較弱的化合物。美國ESA公司于2003年推出的CAD檢測器，靈敏度是ELSD的10倍左右，且線性范圍寬，在中藥分析中有很好的應用前景。

定量核磁共振(qNMR)具有無需對照品，樣品預處理簡單，定量準確等特點。在某些中藥成分的測定中有著獨特優(yōu)勢。

2.2 中藥指紋圖譜分析技術 化學指紋圖譜能表征中藥復雜成分的整體特征，已被 WHO、美國FDA和我國SFDA等藥品監(jiān)管機構采納并用于植物藥或中藥質量檢驗，許多研究者將其用于中藥質量控制。目前，化學指紋圖譜研究以HPLC為主，GC和CE等其它指紋圖譜研究報道較少。當中藥化學物質組成十分復雜，含有多類理化性質差異較大的成分時，使用單一化學指紋圖譜難以涵蓋中藥物質體系的整體化學信息。LC、GC和CE所檢測的化學成分不同，分析信息可互補。為全面表征中藥化學組成，多源指紋圖譜分析技術成為發(fā)展方向。多源色譜指紋圖譜一般采用不同的檢測器同時檢測有紫外吸收和無紫外吸收成分，如LC-UVELSD、LC-UV-MS等。LC指紋圖譜與多指標成分含量測定相結合的定量指紋圖譜能更準確的表達中藥整體信息。此外，中藥譜效關系研究為制定基于藥效的中藥產(chǎn)品質量標準提供了新思路。

2.3 中藥有毒有害成分分析技術 中藥在種植、貯存和制造等過程中會受到農(nóng)藥、重金屬和真菌毒素等有毒有害物質污染，因此急需建立快速、靈敏、專屬的檢測方法來監(jiān)管。檢測中藥中有害殘留物屬痕量或超痕量分析，對儀器分析技術要求很高。目前主要采用 GC-MS或LC-MS檢測中藥有毒有害成分，毛細管電泳-質譜聯(lián)用(CE-MS)檢測法也有少量報道。由于中藥基質復雜，樣品預處理是檢測有害殘留物的關鍵步驟之一，研究適合于不同類型中藥基質的樣品預處理方法十分重要。在2010版《中國藥典》中，真菌毒素的檢測方法為 LCFLD，但已有越來越多的報道使用 LC-MS。LC-MS專屬性高、假陽性率低，今后可能會取代LC-FLD法。檢測重金屬的常用方法包括分光光度法、原子吸收光譜法、原子發(fā)射光譜法、熒光分析法等，但大多只能單個元素測定。新的電感耦合等離子體質譜儀(ICP-MS)可同時測定多個成分，且檢出限更低。

隨著龍膽瀉肝丸、關木通等個別中藥藥害事件的發(fā)生，中藥安全性越來越受到公眾關注，中藥毒性成分檢測已成為中藥質量控制技術研究的重要方面。

3 中藥藥效物質及其作用機制研究領域

3.1 中藥藥效物質篩選技術 生物色譜法出現(xiàn)于20世紀80年代中后期，它將藥效成分的分離與篩選相結合，克服了中藥分離分析的盲目性。親和超濾是近年來發(fā)展的一種篩選技術，具有親和層析的高選擇性和超濾處理樣本快速等優(yōu)點，Choi等將超濾篩選與 LC-MS檢測結合，可快速篩選出作用于QR-2的活性物質。Yasuda將SIRT6酶結合在磁珠上，用于從葫蘆巴提取物中篩選治療低血糖及衰老相關疾病的活性物質。

3.2 中藥作用機制的組學分析技術 中藥的組學研究包括基因組學、蛋白質組學及代謝組學等?；蛐酒亲钪髁鞯慕M學分析技術，常用的蛋白質組學分析有二維電泳(2-DE)、熒光差異二維電泳技術(DIGE)、蛋白質芯片和LC-MS 技術等，代謝組學分析包括 NMR、GC-MS、LC-MS 以及 CE-MS 等技術。UPLCQ-TOF-MS因其性能優(yōu)越，得到了研究者的青睞。

4 中藥體內(nèi)過程及藥代動力學研究領域

中藥體內(nèi)過程分析及藥代動力學研究對于闡明中藥作用機制及指導中藥臨床合理用藥有十分重要的意義。由于中藥藥效成分往往含量很低，體內(nèi)濃度甚微，基質復雜，導致中藥體內(nèi)分析難度很大，要求分析方法具有較高的靈敏度及選擇性。LC-MS/MS可通過選擇反應檢測(SRM)或多反應檢測(MRM)等模式消除背景干擾，提高靈敏度，是中藥體內(nèi)分析的最主要技術。

5 中藥制藥過程質量控制研究領域

過程分析技術(PAT)由美國政府FDA倡導。該技術是通過對整個制藥過程進行分析，深刻了解制藥過程原理，實施制藥過程質量控制，建立科學嚴格的藥品質量保障體系。近紅外光譜是醫(yī)藥工業(yè)最為常用的在線檢測設備，也是PAT在中藥制藥產(chǎn)業(yè)應用研究的熱點。近紅外光譜已用于鑒別藥材來源、測定中藥的主要成分含量，以及在線檢測中藥生產(chǎn)過程的質量指標等。

6 總結與展望

以{主題 =(“chinese medicine”or(herb*not herbicide)or botanical)AND出版類型=(Article)}進行搜索，近5年關于中藥或植物藥研究的SCI收錄文獻量為34 240篇，年平均增幅約為500篇，表明中藥及天然藥物已吸引越來越多的研究者;對論文作者所在國的統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，美國、中國和德國是該領域發(fā)表論文數(shù)量的前三強，美國最多，中國緊隨其后。中藥分析方面的大部分論文采用HPLC方法，而LC-MS已成為主流技術;CE雖在分離效率和分析速度上有諸多優(yōu)勢，但在中藥分析中應用仍較少;UPLC/RRLC作為一種新技術尚未推廣普及。

在未來若干年，聚焦于中藥質量檢驗、中藥藥效物質基礎、現(xiàn)代中藥創(chuàng)制等重點應用領域，中藥分析技術將得到創(chuàng)新發(fā)展，其主要趨勢為:在中藥質量檢驗方面，LC-復合型質譜聯(lián)用技術將得到更多應用，多源化學指紋圖譜研究將取得新突破;中藥藥效物質基礎研究方面涌現(xiàn)出一些新的篩選-分析集成技術，高分辨核磁共振技術得到有效應用;組學分析技術與網(wǎng)絡藥理學及多元藥理學相結合，可望揭示中藥多組分多靶點整合調節(jié)機制，并為創(chuàng)制基于網(wǎng)絡調節(jié)的多靶點新藥提供技術手段。

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