碳酸氫銨防治輪蟲(chóng)及其對(duì)螺旋藻生長(zhǎng)的影響

韓建明，鄭宏倩

（江蘇省農(nóng)科院原子能農(nóng)業(yè)利用研究所，江蘇南京 210014）

螺旋藻（spirulina）作為人類(lèi)未來(lái)重要的健康營(yíng)養(yǎng)資源，自上世紀(jì)70年代開(kāi)始工廠化、商品化生產(chǎn)以來(lái)，其養(yǎng)殖規(guī)模、養(yǎng)殖方式和養(yǎng)殖技術(shù)都得到了很大的發(fā)展[1－3]。然而，隨著室外大規(guī)模開(kāi)放式生產(chǎn)體系的形成，經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)易營(yíng)養(yǎng)液配方的應(yīng)用及鹽堿湖水、海水和污水的資源化利用[4－6]，螺旋藻高成本投入和高環(huán)境要求的產(chǎn)業(yè)屬性正在逐漸弱化，脅迫螺旋藻生長(zhǎng)的逆境因素也愈來(lái)愈多，有些甚至是毀滅性的，輪蟲(chóng)（wheel animalcule）危害即是其中之一。輪蟲(chóng)是一群微小的多細(xì)胞原腔動(dòng)物，主要以微型浮游生物（藻類(lèi)、原生動(dòng)物等）、細(xì)菌、有機(jī)碎屑等為食，體長(zhǎng)0．04～2 mm，大多不超過(guò)0．5 mm，孤雌生殖為主，繁殖速度極快，幾乎呈“爆發(fā)式”增殖。螺旋藻藻池受輪蟲(chóng)污染初期，早晨觀察池面藻體間呈現(xiàn)有銹紅色的點(diǎn)斑狀或不規(guī)則線狀，如不防治，數(shù)天內(nèi)即可將藻絲吃光，導(dǎo)致絕收。由于輪蟲(chóng)和螺旋藻生長(zhǎng)的適宜溫度和光照等自然環(huán)境條件具有相當(dāng)程度的重疊性，加之其遇不良環(huán)境特有的隱生（cryptosis，俗稱(chēng)假死）特性及卵遇逆境脅迫時(shí)呈休眠狀態(tài)，既耐旱又抗寒，生存能力極強(qiáng)，對(duì)一般藥物不敏感[7－8]，因此一旦爆發(fā)極難根治。筆者早在1996年螺旋藻大規(guī)模養(yǎng)殖實(shí)踐中，經(jīng)過(guò)多種化學(xué)制劑和方法的研究篩選，發(fā)現(xiàn)碳酸氫銨（NH4HCO3）殺滅輪蟲(chóng)的效果十分顯著，并沿用至今，安全有效地解決了螺旋藻生產(chǎn)中輪蟲(chóng)危害的難題，為區(qū)域性螺旋藻產(chǎn)業(yè)的快速健康發(fā)展作出了積極的貢獻(xiàn)。

1 材料和方法

1．1 等量（22 L）提取受輪蟲(chóng)嚴(yán)重污染的同一開(kāi)放式螺旋藻培養(yǎng)池藻液置于露天食品周轉(zhuǎn)箱中，施用碳酸氫銨進(jìn)行殺蟲(chóng)試驗(yàn)，碳酸氫銨用量為 50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L、350 mg/L、400 mg/L 和 500 mg/L，分別在處理后 0．5 h、1．0 h、2．0 h、4．0 h、8．0 h、16．0 h 和 24．0 h 用吸管吸取充分?jǐn)嚢杈鶆虻膸x(chóng)藻液通過(guò)顯微鏡觀察統(tǒng)計(jì)輪蟲(chóng)的死亡數(shù)（包括已失去活動(dòng)能力的個(gè)體）和活體數(shù)，比較碳酸氫銨不同用量在不同時(shí)間內(nèi)的殺蟲(chóng)效果。試驗(yàn)期間平均氣溫24．5℃。開(kāi)放式螺旋藻池培養(yǎng)液的基礎(chǔ)配方為：NaHCO310．0 g/L,NaNO31．0 g/L,NaCl 1．0 g/L,KCl 0．5 g/L,KH2PO40．25 g/L，MgSO40．1 g/L,FeSO40．01 g/L,CO(NH2)20．05 g/L。藻體生長(zhǎng)過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)物添補(bǔ)模式一般為：NaHCO30．3 g/L/3 d，CO(NH2)20．01 g/L/d，具體視藻體生長(zhǎng)速度、收獲量、水分蒸發(fā)及降雨等情況而定。

1．2 等量（22L）提取未受輪蟲(chóng)污染的同一開(kāi)放式螺旋藻培養(yǎng)池藻液置于露天食品周轉(zhuǎn)箱中，施用碳酸氫銨作為螺旋藻培養(yǎng)液的添加物，碳酸氫銨用量為150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L和300 mg/L（考慮到試驗(yàn)的主要目的是防治輪蟲(chóng)，參照1．1殺蟲(chóng)試驗(yàn)的結(jié)果，碳酸氫銨＜150 mg/L用量未作處理，也未設(shè)添補(bǔ)其它N源處理作對(duì)照），處理后分別在24 h(D1)、48 h(D2)、和72 h(D3)用721分光光度計(jì)測(cè)定螺旋藻藻液的OD560值，比較不同處理間螺旋藻群體生長(zhǎng)增殖（OD560增加值）的差異。試驗(yàn)期間日平均氣溫為24～26℃。開(kāi)放式螺旋藻池培養(yǎng)液的基礎(chǔ)配方和藻體生長(zhǎng)過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)物的添補(bǔ)模式同1．1。

1．3 生產(chǎn)實(shí)踐中，考慮到白天和夜間螺旋藻生長(zhǎng)特性的不同和輪蟲(chóng)活動(dòng)分布特點(diǎn)的差異，隨機(jī)將受輪蟲(chóng)污染危害的開(kāi)放式螺旋藻培養(yǎng)池分成兩組，分別在上午8：00－9:00時(shí)和下午19:00－20:00時(shí)進(jìn)行殺蟲(chóng)處理，碳酸氫銨用量為200 mg/L，并分別于24 h、48 h、72 h后用721分光光度計(jì)測(cè)定螺旋藻藻液的OD560值，比較碳酸氫銨不同時(shí)間防治輪蟲(chóng)螺旋藻生長(zhǎng)的差異。試驗(yàn)期間日平均氣溫為 25～26℃。

2 結(jié)果和分析

2．1 由表1可以明顯看出：碳酸氫銨用量為500 mg/L時(shí)，半小時(shí)左右?guī)缀?00%的輪蟲(chóng)個(gè)體完全喪失活性，碳酸氫銨用量為400～300 mg/L時(shí)則大概需要1．0～2．0 h；碳酸氫銨用量在250～200 mg/L時(shí)，經(jīng)過(guò)8～16 h殺蟲(chóng)效果可達(dá)到95%以上；碳酸氫銨用量為150 mg/L時(shí)，即使在一天一夜后尚有10%以上的輪蟲(chóng)個(gè)體存活。當(dāng)碳酸氫銨用量為50－100 mg/L時(shí)，根據(jù)本試驗(yàn)觀察到的結(jié)果，24 h內(nèi)的輪蟲(chóng)防治效果只有50%左右或者更低，很顯然這在螺旋藻大規(guī)模開(kāi)放式養(yǎng)殖實(shí)踐中無(wú)實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

表1 碳酸氫銨不同用量對(duì)螺旋藻培養(yǎng)液輪蟲(chóng)的防治效果Tab.1 The control efficiency of NH4HCO3by dose

2.2 圖1所示，碳酸氫銨用量為300 mg/L時(shí)，對(duì)螺旋藻群體的生長(zhǎng)有一定的傷害和抑制作用，這種影響尤以最初24 h最為明顯（OD560增加值為負(fù)），其后逐步恢復(fù)，72 h后趨于正常，這一結(jié)果可能與NH4HCO3溶水后初期高濃度NH3的集中釋放、相對(duì)較高的NH4-N濃度產(chǎn)生一定的毒副作用抑制螺旋藻細(xì)胞生長(zhǎng)或直接導(dǎo)致藻體死亡有關(guān)[9]；當(dāng)碳酸氫銨用量為150～200 mg/L時(shí)，螺旋藻群體生長(zhǎng)效應(yīng)始終表現(xiàn)為正值，并在處理后24～48 h間出現(xiàn)一個(gè)明顯的增殖高峰，第3天生長(zhǎng)趨緩，這無(wú)疑與NH4HCO3溶水后為螺旋藻細(xì)胞生長(zhǎng)提供了適宜的NH4-N源所致；當(dāng)碳酸氫銨用量為250 mg/L時(shí)，螺旋藻群體的生長(zhǎng)效應(yīng)雖然仍為正值，但小于150～200 mg/L處理，這表明在此濃度下，螺旋藻細(xì)胞的增殖已受到某種程度的影響，而且這種影響會(huì)延續(xù)（但有較大弱化）達(dá)48 h，第3天則完全恢復(fù)，這種先抑后揚(yáng)的生長(zhǎng)過(guò)程應(yīng)該與NH4HCO3溶水后培養(yǎng)液中NH3和NH4-N的濃度隨著攪拌揮發(fā)和藻細(xì)胞吸收而發(fā)生改變有關(guān)。由此可見(jiàn)，施用碳酸氫銨作為螺旋藻培養(yǎng)液的添加物，在150～200 mg/L時(shí)對(duì)螺旋藻細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖有著相對(duì)較好的積極作用，但當(dāng)用量達(dá)到250～300 mg/L時(shí)，螺旋藻群體的生長(zhǎng)增殖會(huì)受到相對(duì)不同程度的抑制和傷害。

2.3 圖2所示，碳酸氫銨不同時(shí)間防治輪蟲(chóng)，螺旋藻的生長(zhǎng)表現(xiàn)出一定的差異，這種差異主要出現(xiàn)在最初24 h內(nèi)，其后基本消失。這種差異現(xiàn)象的出現(xiàn)可能與螺旋藻的生長(zhǎng)增殖特性和輪蟲(chóng)的活動(dòng)分布特點(diǎn)在白天、夜間有所不同有關(guān)。白天由于光照影響，輪蟲(chóng)一般分散在螺旋藻培養(yǎng)液的中下層，而在夜間則喜聚于中上層，結(jié)合碳酸氫銨溶水后其水解產(chǎn)物NH3的揮發(fā)性質(zhì)來(lái)看，上午8:00-9:00時(shí)施用碳酸氫銨防治輪蟲(chóng)較之19：00-20:00時(shí)防治處理在最初12 h內(nèi)的殺蟲(chóng)效率可能會(huì)稍低，從而造成相對(duì)更多的藻體細(xì)胞損失。但由于總的防治效果在24 h后并沒(méi)有實(shí)質(zhì)性的差異（表1），因而24 h后兩種處理藻體生長(zhǎng)的速度趨于一致。

圖1 碳酸氫銨不同用量對(duì)螺旋藻生長(zhǎng)的影響Fig.1 The influence on spirulina growth of NH4HCO3

圖2 碳酸氫銨不同時(shí)間防治輪蟲(chóng)螺旋藻生長(zhǎng)的差異Fig.2 The influence on spirulina growth of NH4HCO3by time

3 討論

在螺旋藻大規(guī)模開(kāi)放式培養(yǎng)過(guò)程中，面對(duì)復(fù)雜無(wú)序的自然環(huán)境及一些人為因素的影響，輪蟲(chóng)的污染危害是不可避免的，其對(duì)螺旋藻產(chǎn)量的影響也是相當(dāng)大的，有時(shí)甚至是災(zāi)難性的?？紤]到螺旋藻產(chǎn)品主要作為人類(lèi)健康營(yíng)養(yǎng)食品，使用常規(guī)藥物（如硫酸銅、敵百蟲(chóng)、敵殺死等）進(jìn)行防治，既存在嚴(yán)重的質(zhì)量安全隱患，又極易對(duì)螺旋藻細(xì)胞本身產(chǎn)生毒害[10]。NH4HCO3雖然也是一種化學(xué)合成物質(zhì)，但其分解過(guò)程中并無(wú)有害的中間產(chǎn)物，最終分解產(chǎn)物亦無(wú)毒、無(wú)害、無(wú)殘?jiān)?、無(wú)污染，既環(huán)保又安全。并且NH4HCO3水解過(guò)程中產(chǎn)生的HCO3-、CO2還可直接補(bǔ)充為螺旋藻生長(zhǎng)所需的C源，NH4+則可直接補(bǔ)充為N源。因此，選擇碳酸氫銨防治輪蟲(chóng)如果使用確當(dāng)對(duì)防治輪蟲(chóng)和提高螺旋藻產(chǎn)量可以起到雙贏的效果。參照本文試驗(yàn)結(jié)果，螺旋藻大規(guī)模開(kāi)放式養(yǎng)殖過(guò)程中利用碳酸氫銨防治輪蟲(chóng)的適宜用量（以殺蟲(chóng)為主要目的）推薦為200 mg/L左右，此用量8～16 h內(nèi)防治效果可達(dá)95%以上，同時(shí)對(duì)螺旋藻群體的生長(zhǎng)增殖幾乎不存在實(shí)質(zhì)性的影響。但在實(shí)踐中，這一用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)液連續(xù)使用時(shí)間的長(zhǎng)短，藻體細(xì)胞和培養(yǎng)液滲透壓差的大?。ū┯昵忠u后短時(shí)間內(nèi)滲透壓差會(huì)加大），輪蟲(chóng)危害程度的輕重，培養(yǎng)液中有機(jī)污染物的多少（藻細(xì)胞、微生物、浮游動(dòng)植物、昆蟲(chóng)等生物體的死亡和腐解及風(fēng)、雨、污水、灰塵、肥料等均可能導(dǎo)致有機(jī)污染物的增加），培養(yǎng)液N含量水平的高低，藻群體密度的大小及氣候等因素進(jìn)行調(diào)節(jié)。培養(yǎng)液連續(xù)使用時(shí)間越長(zhǎng)（有害物質(zhì)積累多）、藻體和培養(yǎng)液滲透壓差越大（藻細(xì)胞易破裂）、有機(jī)物污染越重（藻細(xì)胞抗環(huán)境條件突變能力差）、藻群體密度越?。ㄔ寮?xì)胞吸收消耗的NH4-N總量相對(duì)較少）等，碳酸氫銨用量應(yīng)適當(dāng)降低，反之則可適當(dāng)增加。碳酸氫銨用量為150 mg/L時(shí)，一方面在處理后長(zhǎng)達(dá)16 h內(nèi)有60%左右輪蟲(chóng)還沒(méi)有被殺死，危害仍在相當(dāng)程度上持續(xù)擴(kuò)大，這將導(dǎo)致螺旋藻產(chǎn)量進(jìn)一步損失；另一方面雖然在處理24 h后防治效果亦可能近90%，但大面積進(jìn)行輪蟲(chóng)防治時(shí)，碳酸氫銨質(zhì)量差異、人工操作均勻程度、培養(yǎng)液攪拌導(dǎo)致NH3的揮發(fā)、尤其是有效殺死輪蟲(chóng)時(shí)間過(guò)程越長(zhǎng)氣候更是變幻莫測(cè)（特別在多雨季節(jié)）等因素，都可能導(dǎo)致防治效果的下降。加之考慮到輪蟲(chóng)極強(qiáng)的繁殖能力，選用這一劑量無(wú)疑存在著短時(shí)間內(nèi)輪蟲(chóng)再度爆發(fā)危害的風(fēng)險(xiǎn)，并由此還可能更容易產(chǎn)生輪蟲(chóng)抗性的積累。盡管如此，實(shí)踐中這一劑量可以推薦在螺旋藻培養(yǎng)池尚未受到輪蟲(chóng)污染或污染極其輕微時(shí)作為預(yù)防目的應(yīng)用。當(dāng)在螺旋藻池基礎(chǔ)培養(yǎng)液使用初期階段并且其N(xiāo)含量水平處于相對(duì)較低水平而藻細(xì)胞密度又相對(duì)較高時(shí)，如發(fā)生輪蟲(chóng)嚴(yán)重危害，參照本文的試驗(yàn)結(jié)果，筆者認(rèn)為碳酸氫銨施用量也可謹(jǐn)慎加大至250～300 mg/L，處理后伴以較長(zhǎng)時(shí)間的連續(xù)性攪拌，這樣能夠達(dá)到盡快地消除并可以在一定程度上和一定時(shí)間內(nèi)根治輪蟲(chóng)危害的目的。

輪蟲(chóng)依靠體皮滲透作用進(jìn)行呼吸，需要較高的溶解氧。白天螺旋藻利用陽(yáng)光進(jìn)行光合作用，吸收二氧化碳放出氧氣，再加上光線較強(qiáng)（輪蟲(chóng)適宜光照為全暗-10 000 Lx），因此輪蟲(chóng)較多分散于培養(yǎng)液的中下層；夜間螺旋藻呼吸耗氧，導(dǎo)致螺旋藻生長(zhǎng)池內(nèi)溶解氧含量下降，加之輪蟲(chóng)具有一定的趨光性，星月、燈光均可誘導(dǎo)其聚集于培養(yǎng)液的上表層。考慮到NH4HCO3水解過(guò)程中在一定時(shí)間內(nèi)形成的高濃度NH3具有向上揮發(fā)的特性，因此試驗(yàn)中19:00-20:00時(shí)進(jìn)行碳酸氫銨殺蟲(chóng)處理后螺旋藻群體的生長(zhǎng)表現(xiàn)在最初24 h要稍優(yōu)于8:00-9:00時(shí)處理。盡管如此，實(shí)踐中具體防治時(shí)間應(yīng)根據(jù)天氣狀況、輪蟲(chóng)危害程度及便于人工操作等實(shí)際情況靈活安排。

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