不同提取水溫對龍須菜多糖的得率、組成和免疫活性的影響

朱地琴，潘迎捷，唐慶九，張勁松，趙 勇

（1．光明乳業(yè)股份有限公司，乳業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200436；2．上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；3．上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院，食用菌研究所，上海 201403）

龍須菜Gracilariales lemaneiformis是我國重要的大型經(jīng)濟(jì)海藻之一，近年來已在山東、浙江、福建、廣東和海南等省沿海進(jìn)行大規(guī)模栽培[1]，對龍須菜進(jìn)行深加工和高值化利用是龍須菜產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要保證[2－3]。利用龍須菜提煉瓊膠是龍須菜傳統(tǒng)的加工利用方法之一[3－5]，近年來的研究表明龍須菜多糖具有抗腫瘤、抗氧化和抗突變等多種生理活性，龍須菜多糖具有潛在的藥用和保健價(jià)值[4,6－7]，這為龍須菜的加工增值提供了新的方向，因此，龍須菜多糖的研究和利用已引起人們的重視[8－14]。

有研究表明適當(dāng)升高提取水溫有利于提高龍須菜粗多糖的溶出率和瓊膠的提取率[3,7]，但是過高的提取水溫可能會降低海藻多糖的免疫或抗病毒活性[15]，因此，確定合適的提取水溫對于龍須菜活性多糖的提取和利用具有十分重要的意義，然而迄今為止尚未見有關(guān)不同浸提水溫對龍須菜多糖的生化組成和免疫活性的研究，這非常不利于龍須菜多糖的開發(fā)利用。另一方面，由于龍須菜粗多糖中含有較多的膠體，而粗多糖在冷凍后可分為膠體部分（soft－gelling fraction,SGF）和非膠體部分（non－gelling fraction,NGF），且膠體部分的免疫活性遠(yuǎn)低于非膠體部分[8]，因此，龍須菜活性多糖的開發(fā)利用應(yīng)特別關(guān)注其非膠體部分。但是，目前龍須菜活性多糖的提取工藝中通常沒有采用凍融步驟去除膠體[6－7,10－14]，這不僅降低了粗多糖活性，而且不利于活性多糖的分離和純化（由于膠體具有很大的粘度）[15－16]。

鑒于此，本文系統(tǒng)研究了不同浸提水溫對龍須菜非膠體多糖的得率、化學(xué)組成、免疫活性和抗病毒活性的影響，旨在為龍須菜多糖的研究和開發(fā)利用提供理論依據(jù)和實(shí)踐參考，從而提高龍須菜的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，促進(jìn)龍須菜產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和前處理

實(shí)驗(yàn)用龍須菜采自廣東汕頭南澳島，樣品經(jīng)上海海洋大學(xué)馬家海教授鑒定。樣品剔除雜質(zhì)，用自來水洗凈后采用凍干機(jī)冷凍干燥，粉碎后過100目篩，藻粉用塑料袋密封后置于干燥陰涼處保存。使用前在30℃條件下烘干48 h，冷卻后稱重再使用。

1.2 試劑和儀器

苯酚(重蒸)；D-半乳糖和植物凝集素（PHA）（Sigma公司）；BCATM蛋白測定試劑盒(Merck公司產(chǎn)品)；RPMI1640(Biochrom KG 公司)；RPMI1640、胎牛血清、青霉素和鏈霉素(GIBCO 公司)；Alamar Blue Assay(Biosource公司)；濃硫酸、95%乙醇等均為國產(chǎn)分析純試劑；Balb/C小鼠購自中國科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究中心上海分中心。

離心機(jī)（Eppendorf 5810R，Beckman公司）、超低溫冰箱（Thermo FORMAT25，Thermo Forma公司）、凍干機(jī)（Savant Thermo SNL216V，Thermo Savant公司）、T酶標(biāo)儀（BIO-TEK synergy H）、電熱恒溫水浴鍋（HH-S，上海醫(yī)療器械五廠）、分析天平（FA2004N，上海精密科學(xué)儀器有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Buchi公司）。

1.3 活性多糖的提取

分別稱取龍須菜藻粉5 g左右，加入40倍重量的預(yù)熱蒸餾水（預(yù)熱到對應(yīng)組的浸提水溫），于30、40、50、60、70、80、90、100 ℃條件下浸提（共 8 個溫度組），按文獻(xiàn)[15]的方法，浸提前加稀鹽酸調(diào)整懸浮液的pH為6.5，以保證浸提效果。浸提過程中每隔1 h用玻棒攪動浸提液，以便多糖充分溶出，根據(jù)預(yù)備實(shí)驗(yàn)結(jié)果，無論何種溫度組，浸提4 h后粗多糖得率不再增加。因此，浸提4 h后取出浸提液冷卻后離心（8 000×g，20 min），取出上清液后，加蒸餾水于離心管中再離心，如此反復(fù)2次，合并每個樣品的上清液并混勻。按朱地琴等[8]的方法凍融除膠，上清液于-20℃條件下冷凍24 h，然后置于4℃條件下融化，融化液離心（12 000×g，30 min）后得到膠體和非膠體部分，取出非膠體部分在4℃條件下透析（截留分子量為10 000的透析袋），收集分子量大于10 000的部分進(jìn)行冷凍干燥，既得龍須菜非膠體粗多糖，每個溫度組重復(fù)4次。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 粗多糖溶出率和多糖含量測定

將1.3中的冷凍干燥后的粗多糖的膠體和非膠體部分進(jìn)行準(zhǔn)確稱重,據(jù)此計(jì)算各自的溶出率。溶出率（%）=100×溶出部分冷凍干燥后的重量/干藻粉重量。采用苯酚-硫酸法測定多糖含量[17]，采用半乳糖作為標(biāo)樣并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.2 蛋白含量測定

采用BCA TM蛋白測定試劑盒（Merck公司產(chǎn)品）在T酶標(biāo)儀上測定粗多糖樣品的總蛋白含量，具體參照姚毓婧[18]的方法。

1.4.3 硫酸基含量測定

精確稱取5 mg左右的粗多糖樣品，加入1～2 mL的1 mol/L的鹽酸，密封于玻璃管中在105～110℃條件下水解4～5 h，取0.2 mL的水解液加入到3.8 mL的3%三氯乙酸溶液(w/v)中，具體按照DODGSON和PRICE[19]的方法進(jìn)行測定。

1.4.4 3,6-內(nèi)醚半乳糖和半乳糖含量測定

參照YAPHE等[20]和張燕霞等[21]的方法，采用間苯二酚比色法測定3,6-內(nèi)醚半乳糖的含量，采用蒽酮試劑測定3,6-內(nèi)醚半乳糖和半乳糖的總含量，根據(jù)兩者之間的差值計(jì)算出半乳糖的含量，采用分析純的D-果糖和D-半乳糖作為標(biāo)準(zhǔn)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1．4．5 淋巴細(xì)胞免疫試驗(yàn)

按照朱地琴等[8]的方法進(jìn)行淋巴細(xì)胞免疫試驗(yàn)。主要步驟如下：取小鼠脾臟用100目篩在培養(yǎng)皿中磨碎后離心（400×g，6 min），加入氯化氨溶液（濃度為 0．83%）裂解紅細(xì)胞，靜置 10 min 后 400×g離心 6 min，收集的細(xì)胞用PBS緩沖液沖洗數(shù)遍后，臺朌藍(lán)檢查細(xì)胞活力在95%以上。用RPMI1640培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋成2×106個/mL的懸浮液，取180 μL的懸浮液加至96孔板中，同時(shí)加入20 μL樣品（樣品包含空白對照PBS、陽性對照PHA和多糖樣品），于37℃、含5%的CO2條件下培養(yǎng)3 d，測定其570 nm和600 nm處的吸光度，然后加入20 μL Alamar Blue試劑，再培養(yǎng)，變色后再測定570 nm和600 nm處的吸光度，然后根據(jù)Alamar Blue試劑的公式計(jì)算各種樣品對細(xì)胞增殖的影響,計(jì)算公式如下。

增殖率(%)=〔80 856×Aλ570(sample)－117 216×Aλl600(sample)〕/〔80 856×Aλ570(control)－117 216×Aλl600(control)〕×100%

公式中的sample指的是多糖樣品，control指的是空白對照PBS。

1．4．6 抗病毒試驗(yàn)

將冷凍干燥后的非膠體粗多糖送國家新藥篩選中心檢測其抗皰疹病毒Ⅰ和Ⅱ(HSV－Ⅰ和Ⅱ)活性，采用無環(huán)鳥苷（ACV）作為陽性對照藥(湖北科益制藥廠生產(chǎn))，以Vero（非洲綠猴腎）細(xì)胞為病毒宿主，測定樣品抑制皰疹病毒I、II型引起Vero細(xì)胞病變程度。具體步驟如下，將Vero細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，24 h后加入稀釋后的樣品及陽性對照藥37℃培養(yǎng)2 h后分別感染皰疹病毒I型10－3（50倍TCID50感染量）、皰疹病毒II型10－4(30倍TCID50感染量)，吸附2 h，棄培養(yǎng)液,再按以上稀釋度加入樣品，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對照孔和病毒對照孔，48 h觀察細(xì)胞病變程度(CPE)，用Reed－Muench法分別計(jì)算樣品對HSV－I、II型的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1．5 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS11．5軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，所有數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用Levene’s法進(jìn)行齊性方差檢驗(yàn)，當(dāng)不滿足齊性方差時(shí)，對數(shù)據(jù)進(jìn)行反正弦或者平方根轉(zhuǎn)換，采用one－way ANOVA進(jìn)行方差分析，Duncan’s法進(jìn)行多重比較，取 P＜0．05 為差異顯著，P＜0．01 為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2．1 不同提取水溫對龍須菜非膠體粗多糖溶出率、總糖和蛋白含量的影響

由圖1可知，不同提取水溫對龍須菜非膠體粗多糖的溶出率影響顯著(n=24，P＜0．01)，在 30～60℃提取水溫時(shí)非膠體粗多糖的溶出率并沒有顯著差異，70℃時(shí)非膠體粗多糖的溶出率極顯著低于其它各組(P＜0．01)，此后隨著溫度的升高非膠體多糖得率呈現(xiàn)上升趨勢。不同溫度組非膠體部分的多糖含量如圖2，各組的多糖含量均在76%～90%之間，其中50℃和100℃組的多糖含量顯著高于其它各組(n=3，P＜0．05)。不同提取水溫對粗多糖中的蛋白含量影響顯著，50℃組的蛋白含量最低，僅為(4．38±0．13)%，100 ℃組的蛋白含量高達(dá)(7．57±0．43)%(圖 2)。

圖1 不同提取水溫條件下非膠體粗多糖的得率(%干藻粉)Fig．1 Effect of water－extracting temperature on the extraction rate of crude polysaccharide from red seaweed G.lemaneiformis(%dry seaweed powder)

圖2 不同提取水溫條件下粗多糖中的多糖含量(%干非膠體粗多糖)Fig．2 Effect of water－extracting temperature on the polysaccharide content of crude polysaccharide from red seaweed G.lemaneiformis(%dry non－gelling crude polysaccharide)

2．2 不同提取水溫對龍須菜非膠體粗多糖中的硫酸基、3,6－內(nèi)醚半乳糖和半乳糖含量的影響

不同提取水溫對龍須菜非膠體粗多糖中的硫酸基含量有一定的影響(表1)，其中50、60、80和 100℃組的硫酸基含量顯著高于40℃組。不同提取水溫對龍須菜非膠體粗多糖中的3,6內(nèi)醚半乳糖含量影響顯著(n=18,P＜0．05)，70 ℃組的 3,6 內(nèi)醚半乳糖含量最低，僅為(15．04±0．18)%，30 ℃組的3,6 內(nèi)醚半乳糖含量顯著高于其它各組，高達(dá)(20．02±0．58)%。就半乳糖含量含量而言，70和80℃組的含量僅為30%左右，顯著低于其它各組，100 ℃組的含量高達(dá)(40．16±1．08)%。

圖3 不同提取水溫條件下粗多糖中的蛋白含量(%干非膠體粗多糖)Fig．3 Effect of water－extracting temperature on the protein content of crude polysaccharide from red seaweed G.lemaneiformis(%dry non－gelling crude polysaccharide)

表1 不同提取水溫對龍須菜非膠體粗多糖中的硫酸基、3,6－內(nèi)醚半乳糖和半乳糖含量的影響(%干非膠體粗多糖)Tab．1 Effect of water－extracting temperature on sulfate group,3,6－anhydro－galactopyranoseunit and galactopyranoseunit content of red seaweed G.lemaneiformis(%dry non－gelling crude polysaccharide)

2．3 不同提取水溫對龍須菜非膠體粗多糖免疫活性和抗病毒能力的影響

表2為不同提取水溫條件下龍須菜非膠體粗多糖的免疫活性，在同一溫度條件下，粗多糖的免疫活性均隨著多糖濃度的升高而顯著升高；在同一粗多糖濃度條件下，不同提取水溫對其免疫活性有顯著影響，50℃水溫組粗多糖的免疫活性達(dá)最大值，其中200 μg/mL和500 μg/mL兩個劑量組的免疫活性明顯高于陽性對照組的(189．93±13．41)%。此后隨著提取水溫的升高而顯著降低，100℃水溫組粗多糖的免疫活性均低于其它各組，僅為50℃的70%左右。各溫度組非膠體粗多糖均沒有檢測出抗HSV－Ⅰ和Ⅱ活性。

表2 不同提取水溫對龍須菜非膠體粗多糖免疫活性的影響Tab．2 Effect of water－extracting temperature on immune activity of non－gelling polysaccharides form red seaweed G.lemaneiformis

3 討論

龍須菜富含海藻多醣、碘、鈣、鐵等多種人體必需的常量、微量元素和維生素A、B1、C等,先前的研究表明，經(jīng)常食用龍須菜可以清肺通便、養(yǎng)顏瘦身、降血壓血脂和調(diào)理身體機(jī)能等[1]。龍須菜不僅是重要的保健食品,而且是食品工業(yè)提煉瓊膠的上等原料[2-3]。進(jìn)一步的研究表明龍須菜多糖具有抗腫瘤、抗氧化和抗突變等多種生理活性[4-11]，因此對龍須菜進(jìn)行深加工增值具有較大的開發(fā)潛力[1,7-8]。

盡管先前有部分關(guān)于龍須菜多糖提取工藝的研究報(bào)道[2-3,7-8,10-11]，尚未見不同提取水溫對龍須菜非膠體多糖得率、理化性質(zhì)和免疫活性影響的研究報(bào)道，這非常不利于龍須菜資源的深加工利用。盡管陳美珍等[7]研究表明90℃提取水溫條件下，龍須菜得粗多糖溶出率較高，故建議90℃為龍須菜粗多糖得最佳浸提溫度。但是由于上述研究中粗提物包括了膠體多糖和非膠體多糖,而膠體多糖的生理活性較低[8]，由于粗多糖中的膠體具有很大的粘度，非常不利于活性多糖的分離和純化[15-16]。同時(shí)，先前的研究中沒有考慮到不同提取水溫對龍須菜多糖免疫活性的影響，僅以粗多糖溶出率為評價(jià)指標(biāo)確定最佳提取水溫[7]。因此，龍須菜活性多糖的提取應(yīng)該考慮提取水溫對提取物免疫活性及其組成的影響，同時(shí)采用凍溶工藝除去膠體，從而提高其免疫活性和藥用價(jià)值[8,15]。鑒于此，本研究中在凍溶除膠的基礎(chǔ)上，首先采用非膠體粗多糖的溶出率作為活性多糖得率的評價(jià)指標(biāo)，系統(tǒng)研究了不同提取溫度對于龍須菜活性多糖得率、理化性質(zhì)和免疫活性的影響。

本研究結(jié)果表明，50℃提取水溫時(shí)，龍須菜非膠體粗多糖的得率及其多糖含量較高(圖1和圖2)，而蛋白含量較低(圖3)，當(dāng)提取水溫超過60℃時(shí)，非膠體粗多糖的得率顯著下降，這是因?yàn)楦邷貤l件下膠體多糖的得率顯著上升[3]。不管何種劑量組，50℃提取水溫時(shí)，龍須菜非膠體粗多糖的體外免疫活性最高，隨著提取水溫的升高，其免疫活性呈下降趨勢，這可能是因?yàn)楦邷貤l件下粗多糖中含有較多的蛋白等雜質(zhì)，從而影響了其活性。此外，不同提取水溫對多糖的結(jié)構(gòu)和組成可能也存在一定的影響，從而影響其免疫活性[15,22]。先前的研究表明龍須菜活性多糖的主要由交替相連的（1→3）-β-D-半乳糖和（1→4）-α-L-3,6-內(nèi)醚半乳糖重復(fù)二糖組成，分子量約為1.03×105Da[24]。此外，本研究所得非膠體粗多糖中3,6內(nèi)醚半乳糖含量僅為16%～20%，這顯著低于先前的研究報(bào)道[1,12]，這是因?yàn)楸狙芯恐胁捎脙鋈诔z工藝去除了膠體，而3,6-內(nèi)醚半乳糖是膠體的主要成分[4,24]，故本研究中所得非膠體多糖中3,6-內(nèi)醚半乳糖含量偏低。

多糖的免疫機(jī)制十分復(fù)雜，可以從免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫分子各層次刺激巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、殺傷細(xì)胞和B細(xì)胞，增加他們的數(shù)量，從而增加他們的免疫活性[25]，如誘導(dǎo)人體淋巴細(xì)胞產(chǎn)生前列腺素，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素-2，激活淋巴因子等[27]。宮春宇等[9]研究表明龍須菜免疫活性多糖的主要為硫酸基多糖，且免疫活性和硫酸基含量呈正相關(guān)性，本研究結(jié)果表明，50℃提取組的硫酸基含量不僅顯著高于40℃提取水溫組，且高于其它各組，這可能是50℃提取水溫組具有較高免疫活性的原因之一。

本研究結(jié)果表明龍須菜非膠體粗多糖的硫酸基含量在7%～10%，這與余杰等[1]和張昆等[12]的研究結(jié)果類似，在海藻中處于較高水平。有研究結(jié)果表明海藻多糖中的硫酸根含量的高低可能與其抗病毒活性具有一定的相關(guān)性[12,15]。盡管本研究中各組非膠體多糖的硫酸基含量均較高，但是他們并沒有表現(xiàn)出抗病毒活性，這可能和多糖中硫酸基的位置有關(guān)，同時(shí)多糖中甲氧基位置同樣也會影響海藻多糖的抗病毒活性[22]。迄今為止，在特定條件下提取的紅藻多糖絕大多數(shù)均具有抗病毒活性[22-23,27]，而本實(shí)驗(yàn)條件下的龍須菜非膠體粗多糖并沒有表現(xiàn)出抗病毒活性(抗HSV-Ⅰ和Ⅱ)，這可能和我們的提取工藝有關(guān)，盡管水提方法操作簡單、成本低廉[8]，但由于水提法所得的粗多糖中含有較多的蛋白和礦物質(zhì)元素，這可能會影響多糖的抗病毒活性，因此PONCE等[27]建議首先采用70%的乙醇盡量去除海藻中的蛋白和礦物質(zhì)離子，這樣可以得到活性較高的海藻多糖。

4 結(jié)論

不同提取水溫對龍須菜非膠體粗多糖的得率、多糖含量、蛋白含量、硫酸根含量、3,6內(nèi)醚半乳糖、半乳糖含量和免疫活性影響顯著。50℃提取水溫時(shí)，龍須菜非膠體粗多糖的得率、硫酸基含量、體外免疫活性較高，蛋白含量較低；當(dāng)提取水溫超過60℃時(shí)，非膠體粗多糖的得率和免疫活性顯著下降，蛋白含量顯著上升。因此，龍須菜免疫活性多糖的最佳提取水溫建議為50℃。

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