選擇性環(huán)氧化酶-2抑制劑塞來昔布抑制腫瘤生長的裸小鼠體內(nèi)實驗研究

倪志壯，張志廣，李 熳

（天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院消化內(nèi)科，天津300211）

在過去的幾年里人們認識到，非甾體類抗炎藥（NSAIDs）在腫瘤化學預(yù)防中起著重要的作用。有證據(jù)表明，阿司匹林及其他NSAIDs類藥物在消化道腫瘤中可能有預(yù)防性作用[1]。塞來昔布抑制胃癌形成的相關(guān)研究多從胃癌移植瘤出現(xiàn)后或誘導(dǎo)胃癌的同時予以干預(yù)的角度著手,本研究則從裸鼠植瘤前即開始應(yīng)用不同劑量的塞來昔布灌胃干預(yù)的角度出發(fā)，觀察塞來昔布對裸鼠移植瘤生長的抑制作用，并試圖闡明這種抗腫瘤的作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑和儀器 RPMI-1640培養(yǎng)基（天津百若克醫(yī)藥生物技術(shù)有限責任公司）；類標準胎牛血清（中美合資蘭州民海生物工程有限公司）；LRH系列生化培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；HJ-CJ-IFD型單人單面凈化工作臺（上海蘇凈實業(yè)有限公司）；阿拉伯樹膠（北京索萊寶科技有限公司）。

1.1.2 實驗動物與細胞株 5周齡BALB/c雄性去胸腺小鼠36只，體質(zhì)量18~19 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司[許可證號SCXK（京）2009-0004]。胃腺癌細胞系SGC7901購自天津市腫瘤醫(yī)院。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物及細胞株處理 小鼠飼養(yǎng)于獨立通氣籠盒系統(tǒng)（Individually Ventilated Cages）的盒子中，所用墊木、飼料、飲水及籠盒均經(jīng)過高壓滅菌處理，籠外環(huán)境溫度控制在25～28℃。胃腺癌細胞SGC7901在電熱恒溫培養(yǎng)箱中37℃、5%CO2、飽和濕度條件下，用含10%類標準胎牛血清的無菌RPMI1640傳代培養(yǎng)。分離收集對數(shù)期細胞于同一無菌離心管中，用不含血清的無菌RPMI1640懸浮細胞濃度為 5×107/mL。

1.2.2 動物分組與給藥方案 小鼠稱重編號后，按照統(tǒng)計學隨機數(shù)字表將動物隨機分入A、B、C、D 4組，每組9只。A組（對照組）：阿拉伯樹膠給藥劑量為50mg/kg，滅菌雙蒸水配制濃度為10mg/mL溶液。B組：塞來昔布給藥15mg/kg溶于10mg/mL阿拉伯樹膠溶液。C組：塞來昔布給藥30mg/kg溶于10mg/mL阿拉伯樹膠溶液。D組：塞來昔布給藥60mg/kg溶于10mg/mL阿拉伯樹膠溶液。4組動物習服3 d后于同一天灌胃給藥，每天1次，每次0.1mL，灌胃第21天，4組動物由預(yù)實驗同一操作人員在裸鼠右側(cè)腋下皮下接種細胞懸液0.1mL/只（含細胞5×106個）行移植瘤建模，繼續(xù)灌胃給藥干預(yù)至實驗結(jié)束。自實驗開始每天觀察小鼠飲食、活動、大小便及腫瘤生長情況，移植瘤建模第28天實驗結(jié)束。

1.2.3 腫瘤測量與體積計算 游標卡尺記錄4組小鼠植瘤后第7、14、21、28天腫瘤長、短徑。腫瘤體積估算公式：腫瘤體積（mm3）=長徑×（短徑）2/2。分別計算各組小鼠腫瘤生長體積。

1.2.4 腫瘤組織處理 實驗第28天裸鼠稱重、測長短徑后頸椎脫臼法處死小鼠，立即剝?nèi)∧[瘤并浸入10%甲醛固定蠟塊包埋后切片。

1.2.5 方法 免疫組織化學（PV9000）染色法檢測各組組織Ki-67、Bcl-2表達，鼠抗人Ki-67、鼠抗人Bcl-2單克隆抗體及PV-9000二步法免疫檢測試劑盒購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司。嚴格按照試劑盒說明書進行操作。以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗做陰性對照，用已知陽性切片作陽性對照。

1.2.6 結(jié)果評定標準 光學顯微鏡下觀察組織切片，高倍鏡下（×200）隨機觀察不少于5個視野，不少于1 000個腫瘤細胞計數(shù)。Ki-67蛋白表達于細胞核，以細胞核呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性表達，Ki-67染色程度評分參照許良中等[2]所述：基本不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。細胞核陽性數(shù)目百分率：陰性為0分，≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；Bcl-2的蛋白表達評分參照吳軍[3]評分標準，Bcl-2的蛋白于細胞漿，以胞漿呈棕色顆粒為陽性表達，Bcl-2染色程度評分：基本不著色為0分，著色淡為1分，著色深為2分。著色細胞占計數(shù)細胞的百分率：0～5%計為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分。將兩組每張切片染色程度與染色細胞百分率得分乘積作為最后得分。

1.3 統(tǒng)計學分析 選用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料結(jié)果所有數(shù)據(jù)均以表示，采用One way-ANOVA分析，組間比較采用Dunnett’s法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 動物實驗 36只小鼠參與實驗，移植瘤成瘤率100%，實驗整個過程中小鼠飲食、活動等情況良好，未觀察到血尿、血便等異常，至實驗結(jié)束時小鼠全部存活。實驗開始至結(jié)束時所測各組小鼠體質(zhì)量數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計學意義。

2.2 塞來昔布對裸鼠移植瘤生長的影響 由表1可見，塞來昔布可以抑制移植瘤生長，與A組對照組比較，B、C、D 3組實驗組移植瘤體積從第7天即表現(xiàn)出差異（P<0.001）；至植瘤后28 d實驗結(jié)束，實驗組較對照組對移植瘤生長均保持抑制，移植瘤體積有差異（P<0.001）。組內(nèi)比較：B、C、D 3組在植瘤后第 14 天移植瘤體積有差異（B∶C，P<0.01，B∶D，P<0.001，C∶D，P<0.01），表現(xiàn)為 D 組較 B 組、C 組對移植瘤生長抑制作用更為顯著（B∶D，P<0.001，C∶D，P<0.01），這種抑制作用一直到實驗結(jié)束。

表1 塞來昔布對裸鼠移植瘤生長的影響(n=36，mm3)Tab 1 Effectof celecoxib on thegrow th of xenografts(n=36，，mm3)

表1 塞來昔布對裸鼠移植瘤生長的影響(n=36，mm3)Tab 1 Effectof celecoxib on thegrow th of xenografts(n=36，，mm3)

B、C、D 3組分別與A組比較△P<0.001；B組與C組比較▲P<0.01，B組與D組比較★P<0.001；C組與D組比較茛P<0.01

塞來昔布濃度/[mg/（kg·d）]0（A 組）15（B 組）30（C 組）60（D 組）F 21 d 577.45±60.83 423.93±36.06△▲★316.79±29.26△茛215.41±25.84△132.347 14 d 214.17±24.28 125.02±16.23△▲★90.45±10.08△茛48.36± 8.19△174.977 7 d 26.88±5.03 15.75±2.31△★13.59±2.74△茛8.81±1.54△52.072 28 d 1 397.24±228.69 787.68± 95.73△▲★627.72± 47.30△茛532.25± 51.91△98.762

2.3 細胞Ki-67與Bcl-2表達 見表2。Ki-67陽性細胞為細胞核呈棕黃色或棕褐色染色（圖1）。本次實驗結(jié)果表明，與對照組比較，塞來昔布30mg/（kg·d）及塞來昔布60mg/（kg·d）能抑制Ki-67表達；組內(nèi)比較有差異（B∶C，P<0.05；B∶D，P<0.05；C∶D，P<0.01），塞來昔布在本次60mg/（kg·d）較塞來昔布15mg/（kg·d）、30mg/（kg·d）更能抑制Ki-67表達（B∶D，P<0.05；C∶D，P<0.01）。Bcl-2 陽性細胞為細胞質(zhì)棕色染色（圖2）。A組與B、C、D 3組分別比較有差異（P<0.001），組內(nèi)比較無差異（P>0.05），塞來昔布可抑制Bcl-2蛋白表達。

表2 細胞K i-67與Bcl-2表達(n=36)Tab 2 Exp ression of K i-67 and Bcl-2(n=36)

表2 細胞K i-67與Bcl-2表達(n=36)Tab 2 Exp ression of K i-67 and Bcl-2(n=36)

Ki-67：C、D組分別與A 組比較◆P<0.01；B組與C組比較，■P<0.05，B組與D組比較，襋P<0.001；C組與D組比較□P<0.01；Bcl-2：A組與B、C、D 組比較●P<0.001，組間比較●P>0.05

Ki-67 4.05±0.18 3.89±0.18■襋◣3.60±0.16◆□2.83±0.47◆35.288塞來昔布/[mg/（kg·d)]0（A 組）15（B 組）30（C 組）60（D 組）F Bcl-2 0.92±0.05 0.78±0.04●0.75±0.06●0.74±0.05●26.273

3 討論

目前已發(fā)現(xiàn)的環(huán)氧化酶（COX）有兩種：結(jié)構(gòu)型酶環(huán)氧化酶-1（COX-1）和誘導(dǎo)型酶環(huán)氧化酶-2（COX-2）。COX-1產(chǎn)生的前列腺素參與胃黏膜的保護、血小板的聚集、血管內(nèi)平衡、維護腎臟的鈉水平衡等生理功能，COX-2產(chǎn)生的前列腺素主要干預(yù)炎癥反應(yīng)以及參與細胞增殖的某些過程[4]。COX-2對于炎癥反應(yīng)和腫瘤過程而言都是一個重要的因素，COX-2在大多數(shù)的上皮細胞不表達或表達很低，但是在炎癥病變及多種癌前病變和腫瘤中高表達，因此這也是作為腫瘤和炎癥的預(yù)防以及治療的靶點[5]。

有研究表明非甾體類抗炎藥（NSAIDs）可以降低食管癌[6]、結(jié)腸癌[7]等腫瘤的發(fā)病風險。由于NSAIDs對COX抑制無選擇性,導(dǎo)致臨床應(yīng)用阿司匹林、吲哚美辛等非選擇性COX抑制劑引起如胃潰瘍、出血等上消化道不良反應(yīng)，目前認為這些不良反應(yīng)的產(chǎn)生主要由于抑制COX-1引起，因此長期應(yīng)用此類藥物用于抑制腫瘤生長將不夠理想。塞來昔布是第一個進入臨床的選擇性COX-2抑制劑，擁有與NSAIDs相似的抗炎、止痛效果，但沒有NSAIDs抑制COX-1所引起的上消化道不良反應(yīng)[8]。COX-2在胃癌及癌前病變中表達升高，并且COX-2表達陽性的胃癌患者預(yù)后不良[9]。

細胞的增殖和凋亡是維護細胞和組織平衡的重要機制。胃癌的發(fā)生發(fā)展與細胞過度增殖及細胞凋亡異常相關(guān)[10]，同時具有抑制腫瘤細胞增殖、促進細胞的凋亡作用而安全性好的藥物更值得進一步探尋。Ki-67抗原為存在于細胞核的一種非組蛋白性核蛋白，是與細胞增殖相關(guān)的核抗原[11]，陽性率能反映細胞增殖的情況，因此，Ki-67表達降低也表明細胞增殖受到抑制。張宏玲等[12]體外研究表明，塞來昔布能夠抑制胃癌細胞SGC7901生長。Yashiro等[13]研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用選擇性COX-2抑制劑可以抑制胃癌細胞系OCUM-2M及NF-21 COX-2及Ki-67的表達。Jun等[14]研究發(fā)現(xiàn)，塞來昔布預(yù)防用藥可以抑制N-甲基-硝基-N亞硝基胍誘導(dǎo)的Wistar大鼠胃癌的發(fā)生，并且抑制腫瘤細胞Ki-67的表達，成劑量依賴性的增加腫瘤細胞的凋亡。本實驗從體內(nèi)研究角度進一步證實了選擇性COX-2抑制劑塞來昔布可以抑制移植瘤生長，降低移植瘤Ki-67表達，間接表明塞來昔布具有抑制腫瘤細胞增殖的作用，這種抑制作用呈劑量依賴性，本實驗中，低劑量塞來昔布組（15mg/kg）Ki-67的表達與對照組比較未體現(xiàn)差異（P>0.05），可能與本次實驗塞來昔布所用濃度較低有關(guān)。

塞來昔布有包括抗腫瘤在內(nèi)的多種作用，大量研究表明塞來昔布可以通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族成員的表達及線粒體途徑介導(dǎo)細胞的凋亡[15]。崔京遠等[16]研究發(fā)現(xiàn)，塞來昔布可以抑制SGC7901增殖，抑制Bcl-2表達。孫現(xiàn)軍等[17]研究結(jié)果表明，選擇性COX-2抑制劑塞來昔布作用于SGC7901細胞呈劑量依賴性下調(diào)COX-2及Bcl-2蛋白的表達，誘導(dǎo)細胞凋亡。Bcl-2即B細胞淋巴瘤/白血病-2基因，為一種原癌基因，正常及病理情況下，Bcl-2有抑制細胞凋亡功能[18]，因此促進細胞Bcl-2表達的下調(diào)也利于促進細胞的凋亡。本次實驗Bcl-2免疫組化結(jié)果表明，塞來昔布可以下調(diào)Bcl-2蛋白的表達，促進腫瘤細胞凋亡，實驗組內(nèi)免疫組化結(jié)果比較Bcl-2蛋白的表達無差異（P>0.05）。

本次研究表明，塞來昔布可抑制移植瘤生長，表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤作用，這種作用與塞來昔布劑量相關(guān)，與張宏玲[12]、崔京遠等[16]得出的結(jié)論一致，本次實驗研究應(yīng)用塞來昔布60mg/（kg·d）較塞來昔布15mg/（kg·d）、30mg/（kg·d）抑制腫瘤生長更顯著，其抗腫瘤生長作用機制可能通過降低Ki-67表達從而抑制腫瘤細胞增殖、抑制Bcl-2表達促進腫瘤細胞凋亡途徑實現(xiàn)。Susan等[19]動物實驗表明，裸小鼠用塞來昔布（較低劑量為10mg/kg）灌胃給藥24 h后，小鼠血內(nèi)仍可測得塞來昔布存在，因此本次實驗塞來昔布抑制移植瘤生長作用考慮為造模前及造模后塞來昔布綜合起作用的結(jié)果。

[1]Baron JA.Epidemiology of non-steroidal anti-inflammatory drugs and cancer[J].Prog Exp Tumor Res,2003,37:1

[2]許良中，楊文濤.免疫組織化學反應(yīng)結(jié)果的判斷標準[J].中國癌癥雜志，1996，6（4）：229

[3]吳軍，張志廣，李熳，等.胃癌組織中HIF-1α、Bax、Bcl-2的表達及意義[J].天津醫(yī)科大學學報，2010，16（2）：226

[4]王瑞，次仁央金，楊錦林，等.塞來昔布通過誘導(dǎo)非類固醇消炎藥物激活基因（NAG-1）加強胃癌細胞的凋亡[J].四川大學學報（醫(yī)學版），2009，40（6）:1029

[5]Uddin M J,Crews BC,Ghebreselasie K,etal.Fluorinated COX-2 inhibitorsasagents in PET imaging of inflammation and cancer[J].Cancer PreRes（Phila）,2011,4（10）:1536

[6]Liao LM,Vaughan TL,Corley D A,etal.Nosteroidalanti-inflammatory drug use reduces risk of adenocarcinomas of the esophagus and esophagogastric junction in a pooled analysis[J].JGastroenterol,2012,142（3）:442

[7]Vaish V,Sanyal SN.Roleof Sulindac and Celecoxib in chemoprevention of colorectal cancer via intrinsic pathway of apoptosis:Exploring NHE-1,intracellular calcium homeostasisand Calpain 9[J].Biomed Pharmacother,2012,66（2）:116

[8]McCormack PL.Celecoxib:a review of itsuse for symptomatic relief in the treatmentofosteoarthritis,rheumatoid arthritis and ankylosingspondylitis[J].Drugs,2011,71（18）:2457

[9]ThielA,Mrena J,Ristim覿kiA.Cyclooxygenase-2 and gastric cancer[J].CancerMetastasisRev,2011,30（34）:387

[10]Saegusa M,Takano Y,Wakabayashi T,et al.Apopotosis gastric carcinomasand itsassociationwith cellproliferation and differentiation[J].Jpn Cancer Res,1995,86（8）:743

[11]Okimura A,Hirano H,Nishigami T,et al.Immunohistochemical analysesofE-cadherin,beta-catenin,CD44s,and CD44v6 expressions,and Ki-67 labeling index in intraductal papillarymucinous neoplasms of the pancreas and associated invasive carcinomas[J].Med MolMorphol,2009,42（4）:222

[12]張宏玲，劉敏，陳兆峰，等.塞來昔布干預(yù)對人胃癌細胞E-鈣粘蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶-2表達的影響[J].胃腸病學和肝病學雜志，2012，21（5）：393

[13]YashiroM,Nakazawa K,TendoM,etal.Selective cyclooxygenase-2 inhibitor downregulates the paracrine epithelial-mesenchymal interactionsofgrowth in scirrhousgastric carcinoma[J].Int JCancer,2007,120（3）:686

[14]Jun Y,Bao-Dong T,Wai K,etal.Different cell kinetic changes in rat stomach cancer after treatmentwith celecoxib or indomethacin:Implications on chemoprevention[J].World JGastroenterol,2005,11（1）:41

[15]Winfield L L,Payton-Stewart F.Celecoxib and Bcl-2:emerging possibilities for anticancer drug design[J].FutureMed Chem,2012,4（3）:361

[16]崔京遠，馬紅，李梅，等.塞來昔布聯(lián)合順鉑對SGC7901人胃癌細胞凋亡及Bcl-2表達的影響 [J].中國現(xiàn)代普通外科進展，2009，12（6）：466

[17]孫現(xiàn)軍，侯文紅，馬恒，等.選擇性COX-2抑制劑Celecoxib對胃癌細胞增殖影響的探討[J].中國腫瘤臨床，2000，31（20）：1171

[18]SUNP,Liu Y,YingH,etal.Actionofdb-cAMPon thebystandereffectand chemosensitivity through connexin 43 and Bcl-2mediated pathwaysinmedulloblastomacells[J].OncolPep,2012,28（3）:969

[19]Paulson SK,Kaprak TA,Grtsk C J,etal.Plasmaprotein bindingof celecoxib in mice,rat,rabbit,dog and human[J].Biopharm Drug Dispos,1999,20（6）:293