Src酪氨酸激酶抑制劑對人胃癌細(xì)胞SGC7901上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變相關(guān)基因的作用及機(jī)制

林 偉，陳金坤，邱仙土，陳建新

（福建省莆田學(xué)院附屬醫(yī)院普通外科，莆田351100）

近年來，腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和腫瘤浸潤及轉(zhuǎn)移的關(guān)系備受關(guān)注。EMT是指上皮細(xì)胞與周圍間質(zhì)細(xì)胞相互作用，E-鈣黏素(E-cadherin)等細(xì)胞粘附分子表達(dá)減少，細(xì)胞間連接解體，細(xì)胞分散，角蛋白為主的細(xì)胞骨架逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)椴ㄐ蔚鞍诪橹鞯募?xì)胞骨架，導(dǎo)致細(xì)胞骨架重排，纖粘連蛋白表達(dá)增加，細(xì)胞粘附能力下降、運(yùn)動能力增強(qiáng)，逐漸喪失上皮細(xì)胞極性獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的過程[1]。EMT可使沒有侵襲的腫瘤細(xì)胞獲得浸潤能力，促進(jìn)腫瘤形成局部浸潤和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。胃癌是最常見的消化系統(tǒng)腫瘤之一，早期發(fā)現(xiàn)率低，確診時多數(shù)已出現(xiàn)了腫瘤轉(zhuǎn)移，因此抑制腫瘤轉(zhuǎn)移是治療胃癌的關(guān)鍵。Src酪氨酸激酶已經(jīng)被證明與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，本文旨在探討Src酪氨酸激酶抑制劑對人胃癌細(xì)胞SGC7901上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變的抑制作用及機(jī)制，為臨床應(yīng)用Src酪氨酸激酶抑制劑治療胃癌轉(zhuǎn)移提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 人胃癌細(xì)胞SGC7901購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，Src酪氨酸激酶抑制劑4-苯胺喹唑啉購自AstraZeneca公司，化學(xué)發(fā)光HRP底物購自Millipore公司，real-time PCR系統(tǒng)購自ABI公司，雙熒光報(bào)告基因檢測系統(tǒng)購自Promega公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) SGC7901細(xì)胞于5%CO2、37℃、飽和濕度條件下，以RPMI1640培養(yǎng)液（含10%小牛血清）中培養(yǎng)及0.25%胰酶-EDTA消化，采用對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 4-苯胺喹唑啉對細(xì)胞生長的抑制作用 細(xì)胞2×104/mL接種于96孔板，每孔0.1mL，溫育24 h后，分別加入不同濃度的4-苯胺喹唑啉，分別設(shè)置細(xì)胞對照及空白對照，每組樣本設(shè)5個復(fù)孔，溫育48 h后，加入MTS，培養(yǎng)2 h后測定吸光度值（490 nm）。

1.4 4-苯胺喹唑啉對p-Src、E-cadherin及β-連環(huán)蛋白（β-catenin）表達(dá)的影響 將細(xì)胞接種于直徑10 cm培養(yǎng)皿上，待細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿的90%時，給予不同濃度的Src酪氨酸激酶抑制劑4-苯胺喹唑啉（5和10μmol/L）37℃下溫育6 h，用預(yù)冷的PBS漂洗2次，立即加入300μL細(xì)胞裂解液，4℃下14 000×g離心5min，取上清液，用Bradford蛋白分析試劑測量所提取蛋白的濃度。

取100μg蛋白樣品行SDS-PAGE分離蛋白,隨后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉非特異性抗原1 h，加入兔抗人Src酪氨酸磷酸化特異性多克隆抗體1∶500稀釋（Millipore），鼠抗人E-cadherin 單克隆抗體 1∶500 稀釋（Santa Cruz），鼠抗人 β-catenin單克隆抗體 1∶500稀釋（Santa Cruz），1∶200稀釋的鼠抗人 β-actin單克隆抗體（Sigma）作為內(nèi)對照，4℃反應(yīng)過夜，用含0.1%Tween 20的TBS洗膜，加入1∶1 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫下反應(yīng)1 h，洗膜后DAB顯色，將條帶結(jié)果進(jìn)行掃描。

1.5 4-苯胺喹唑啉對E-cadherin及 β-catenin mRNA表達(dá)的影響 將細(xì)胞3×105/mL接種于6孔板，用不同濃度的Src酪氨酸激酶抑制劑4-苯胺喹唑啉（5和10μmol/L）37℃下溫育6 h，收集細(xì)胞后用TRIzol抽提總RNA，并將GAPDH作為內(nèi)參照，用以下引物序列擴(kuò)增：E-cadherin上游引物序列：5′-GTCACTGACACCAACGATAATCCT-3′，下游引物序列：5′-TTTCAGTGTGGTGATTACGACGTTA-3′；β-catenin 上游引物序列：5′-GCTCTTCGTCATCTGACCAGCC-3′，下游引物序列：5′-GAGCAAGTTC ACAGAGGACCC-3′；GAPDH 上游引物序列：5′-CCACCCATGGCAAATTCC-3′；下游引物序列：5′-GATGGGATTTCCATTGATGACA-3′。擴(kuò)增條件為：預(yù)變性94℃，5min，共進(jìn)行35個循環(huán)擴(kuò)增，每一循環(huán)包括 95 ℃ 5 s、65 ℃ 35 s。

1.6 4-苯胺喹唑啉對Snail啟動子活性的影響 將SGC7901細(xì)胞3×105/mL接種于6孔板，用不同濃度4-苯胺喹唑啉（5、10μmol/L）溫育 6 h，應(yīng)用 LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染pSnail-luc和CMV啟動子海腎

熒光酶內(nèi)標(biāo)報(bào)告基因載體24 h后，用雙熒光酶測定試劑盒檢測Snail的轉(zhuǎn)錄活性，計(jì)算螢火蟲熒光酶激發(fā)光子數(shù)目和海腎熒光酶激發(fā)光子數(shù)目的比值。Snail啟動子序列為：Sense ：5′-CCAGATCTCAAAGCACACTTCCCTTTGCATTG-3′； Antisense：5′-GGGCCATGGTGGTCGAGGCACTGGGGTC-3′。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4-苯胺喹唑啉對SGC7901細(xì)胞生長的抑制作用 4-苯胺喹唑啉在10μmol/L時對SGC7901細(xì)胞無明顯毒性，超過此濃度后，4-苯胺喹唑啉對SGC7901細(xì)胞增殖的抑制作用呈劑量依賴性，因此選擇5μmol/L及10μmol/L 4-苯胺喹唑啉進(jìn)行研究。

2.2 4-苯胺喹唑啉對SGC7901細(xì)胞Src酪氨酸激酶磷酸化的抑制 如圖1所示，4-苯胺喹唑啉可顯著抑制SGC7901細(xì)胞中Src蛋白的自主磷酸化（p-Src），且呈現(xiàn)劑量依賴性。

2.3 4-苯胺喹唑啉對SGC7901細(xì)胞中E-cadherin及β-catenin表達(dá)的影響 如圖2所示，4-苯胺喹唑啉可增加SGC7901細(xì)胞E-cadherin在mRNA及蛋白水平表達(dá)，抑制β-catenin在mRNA及蛋白水平表達(dá)，且呈現(xiàn)劑量依賴性。當(dāng)4-苯胺喹唑啉濃度為5和10μmol/L時，SGC7901細(xì)胞中E-cadherin的 mRNA表達(dá)是對照組的 161.2%（P<0.05）和298.1%（P<0.05），β-catenin的 mRNA 表達(dá)是對照組的 63.9%（P<0.05）和 19.6%（P<0.05）（表 1）。

表1 4-苯胺喹唑啉對SGC7901細(xì)胞中E-cadherin和β-catenin mRNA表達(dá)的影響Tab 1 Effectof 4-anilinoquirazolineon E-cadherin andβ-catenin mRNA expression in SGC7901 cells

2.4 4-苯胺喹唑啉對SGC7901細(xì)胞Snail啟動子活性的抑制 如圖3所示，4-苯胺喹唑啉可降低SGC7901細(xì)胞Snail啟動子活性，且呈現(xiàn)劑量依賴性。4-苯胺喹唑啉濃度為5和10μmol/L時，Snail啟動子活性是對照組的62.3%（P<0.05）和18.3%（P<0.05）。

3 討論

EMT是胚胎發(fā)育過程中所必需的生理機(jī)制，隨著EMT的研究不斷深入，其在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用不斷被發(fā)現(xiàn)，成為EMT研究的熱點(diǎn)。腫瘤細(xì)胞在EMT過程中發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，E-cadherin逐漸喪失，波形蛋白、纖連接蛋白表達(dá)增加，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞極性喪失，與周圍組織、細(xì)胞接觸減少，遷移能力增強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)，Src酪氨酸激酶在胃癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中均發(fā)生異常活化，引起腫瘤細(xì)胞生長、增殖和黏附的異常，導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲能力增強(qiáng)[2-3]。本研究證明，Src酪氨酸激酶抑制劑4-苯胺喹唑啉可抑制在SGC7901細(xì)胞中Src酪氨酸激酶磷酸化并呈劑量依賴關(guān)系，我們以此考察4-苯胺喹唑啉抑制人胃癌細(xì)胞EMT的作用及機(jī)制。

E-cadherin是重要的粘附分子，也是EMT的重要標(biāo)志物，對維持上皮表型、穩(wěn)定細(xì)胞間接觸有重要意義。E-cadherin蛋白隨著腫瘤惡性程度上升而下降，在正常組織中呈強(qiáng)表達(dá)，在腫瘤組織中呈低表達(dá)，甚至不表達(dá)。E-cadherin水平的下降可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞黏附力降低，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲性增加[4]。本研究發(fā)現(xiàn)4-苯胺喹唑啉抑制Src酪氨酸激酶活性后，可顯著地增加胃癌細(xì)胞中E-cadherin的mRNA與蛋白表達(dá)，表明4-苯胺喹唑啉抑制EMT過程可能與其增加腫瘤細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)有關(guān)。

β-catenin作為細(xì)胞黏附分子和信號傳導(dǎo)分子在維持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能方面發(fā)揮重要的作用，可作為細(xì)胞骨架成份參與細(xì)胞黏附，并在細(xì)胞核內(nèi)參與基因轉(zhuǎn)錄。β-catenin是經(jīng)典的E-cadherincatenin復(fù)合體的重要成員，可與E-cadherin結(jié)合參與細(xì)胞黏附，參與細(xì)胞間的連接。β-catenin也是Wnt信號通路中調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵蛋白，可進(jìn)入細(xì)胞核與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF形成復(fù)合體，進(jìn)而激活 c-myc、cyclinD1、MMPs等一系列 Wnt信號靶基因的轉(zhuǎn)錄，其異常表達(dá)對腫瘤的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移有重要作用，促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變[5]。本研究中4-苯胺喹唑啉可顯著地抑制胃癌細(xì)胞中β-catenin的mRNA與蛋白表達(dá)，表明4-苯胺喹唑啉對EMT的抑制作用可能與其抑制腫瘤細(xì)胞β-catenin表達(dá)有關(guān)，其機(jī)制可能與穩(wěn)定的E-cadherin-catenin復(fù)合體，抑制 c-myc、cyclinD1、MMPs等促癌基因活化，從而抑制上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變相關(guān)基因的表達(dá)。

近年來，許多研究證實(shí)Snail等多種轉(zhuǎn)錄因子在腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用，可通過抑制E-cadherin的表達(dá)來促進(jìn)EMT的發(fā)生。Snail屬于鋅指蛋白，可通過與Smad相互作用競爭性結(jié)合E-cadherin啟動子區(qū)的E-box序列，抑制E-cadherin表達(dá)，上調(diào)βcatenin表達(dá)，誘導(dǎo)EMT的發(fā)生[6]。Snail啟動子活性的降低可下調(diào)Snail表達(dá)，進(jìn)而降低對E-cadherin表達(dá)的抑制作用。本研究中4-苯胺喹唑啉可顯著地抑制胃癌細(xì)胞中Snail轉(zhuǎn)錄活性，表明4-苯胺喹唑啉對EMT的抑制作用可能與其抑制腫瘤細(xì)胞Snail啟動子活性有關(guān)。

綜上所述，Src酪氨酸激酶的活性與胃癌EMT密切相關(guān)，其機(jī)制可能為Src酪氨酸激酶可調(diào)節(jié)Snail轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)E-cadherin及β-catenin表達(dá)有關(guān)。本研究表明，Src酪氨酸激酶抑制劑4-苯胺喹唑啉可顯著抑制EMT的發(fā)生發(fā)展，為臨床胃癌治療提供了理論依據(jù)。

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