動(dòng)態(tài)濁度法定量檢測(cè)地龍注射液中的細(xì)菌內(nèi)毒素

廣東省佛山市禪城區(qū)中心醫(yī)院（528031）張朝陽(yáng) 歐有權(quán) 羅潤(rùn)嫦 賴(lài)永娥

本文通過(guò)動(dòng)態(tài)濁度法定量檢測(cè)地龍注射液中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量，建立地龍注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素定量分析的方法。

1 材料與儀器

地龍注射液（批號(hào)：0909404、901007、090702，規(guī)格：2ml/支，廣東省博羅先鋒藥業(yè)集團(tuán)有限公司）；動(dòng)態(tài)濁度鱟試劑（批號(hào)：0907252，1.25mL/支，湛江安度斯生物有限公司）；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：150601-200961，150/支，中國(guó)藥品生物制品檢定所）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（批號(hào)：0909080，5mL/支，湛江安度斯生物有限公司）；BET-32B型細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀（天津大學(xué)無(wú)線電廠）；ZH-2型漩渦混合器（天津藥典儀器廠）。

附表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)

附表2 地龍注射液干擾預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

附表3 地龍注射液定量檢查結(jié)果

2 方法與結(jié)果

2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素限值的確定 按細(xì)菌內(nèi)毒素限值公式L=K/M，K為人用每kg體重每1h最大可接受的內(nèi)毒素劑量，非放射性注射劑的K值為5.0Eu?kg-1?h-1，M為1h內(nèi)每kg體重人的最大給藥劑量。地龍注射液〔國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局中成藥地方標(biāo)準(zhǔn)上升國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)部分（內(nèi)科肺系一分冊(cè)）WS-11340（ZD-1340）2002〕一次2ml，其L值為L(zhǎng)=K/M=5/（2/60）=150Eu/ml。考慮到藥廠可作中間產(chǎn)品的質(zhì)量控制，把安全系數(shù)提高5倍。限值確立為L(zhǎng)=150Eu/ml÷5=30Eu/ml。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及可靠性[1]用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行溶解稀釋?zhuān)蛊渥罱K內(nèi)毒素濃度分別為5.0，1.0，0.2，0.04Eu/ml稀釋系列。各取0.2ml分別加到預(yù)先加有0.1ml動(dòng)態(tài)濁度鱟試劑反應(yīng)管內(nèi)，混合均勻。立即插入BET-32B型細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀進(jìn)行自動(dòng)檢測(cè)，其中每一濃度做2支平行管，并同時(shí)做2支陰性對(duì)照管（NC）（見(jiàn)附表1）。

結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)曲線為lgT=2.7465+（-0.22252lgC），r=0.9931，|r|＞0.980，標(biāo)準(zhǔn)曲線最低內(nèi)毒素濃度點(diǎn)λ1=0.04Eu/ml，陰性對(duì)照內(nèi)毒素小于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)，標(biāo)準(zhǔn)曲線成立。

2.3 干擾實(shí)驗(yàn)

2.3.1 供試品最大稀釋倍數(shù)計(jì)算[1]按公式MVD=L?C/λ，地龍注射液的L=30EU/ml，C為1.0 ml/ml，選取0.04～5.0Eu/ml的范圍測(cè)試。標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低內(nèi)毒素濃度λ1為0.04Eu/ml，其最大稀釋倍數(shù)均為MVD=30×1.0/0.04=750倍。

2.3.2 供試品溶液配制及干擾預(yù)實(shí)驗(yàn)[2][3]將地龍注射液（批號(hào)0909404）的pH值調(diào)至6.0～8.0，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水依次稀釋為1∶50，1∶100，1∶200等比系列稀釋液，作為供試品空白管（Et）。同時(shí)再分別取內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為2λ(λ為中點(diǎn)濃度0.5 Eu/ml)和供試品各等比系列的2倍濃度稀釋液，在稀釋用試管中等量混合，得到在此稀釋倍數(shù)下含λm內(nèi)毒素的供試品溶液，作為供試品陽(yáng)性管（Es）。分別取上述溶液各0.2ml加入預(yù)先加有0.1ml動(dòng)態(tài)濁度法鱟試劑反應(yīng)管內(nèi)，混合均勻。立即插入BET-32B型細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀進(jìn)行自動(dòng)檢測(cè)，其中每一濃度做2支平行管，并同時(shí)做2支陰性對(duì)照管（NC），2支陽(yáng)性對(duì)照管（PC）。計(jì)算回收率（%）=（Es-Et）/λ×100%（見(jiàn)附表2）。供試品等比稀釋液中，1∶50，1∶100，1∶200稀釋液的回收率分別為147%和113%和116%。稀釋液的回收率均在50%～200%之間，符合中國(guó)藥典規(guī)定。在日常檢查中選1∶100稀釋液。

2.4 定量檢查 根據(jù)以上預(yù)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)3批地龍注射液以1∶100稀釋液進(jìn)行定量檢查（見(jiàn)附表3）。

3 討論

3.1 動(dòng)態(tài)濁度法有快速、大范圍定量的特性，使干擾實(shí)驗(yàn)在一兩次實(shí)驗(yàn)后完成，節(jié)約成本，更適合于成份復(fù)雜，干擾大的中藥注射劑的內(nèi)毒素檢測(cè)。

3.2 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，地龍注射液稀釋倍數(shù)在100倍時(shí)，測(cè)得的內(nèi)毒素回收率為113%，回收率接近100%，最接近真實(shí)值。經(jīng)3批供試品干擾試驗(yàn)結(jié)果測(cè)得的內(nèi)毒素回收率均接近100%，表明該稀釋倍數(shù)的供試品溶液對(duì)本試驗(yàn)已無(wú)干擾作用。