一例疑似豬細(xì)小病毒感染流行的實(shí)驗(yàn)室診斷

陳招娣，李潤(rùn)成*，蔣大良，余興龍

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128）

豬細(xì)小病毒病是由豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus，PPV)引起，以母豬特別是初產(chǎn)母豬繁殖障礙為特征的一種病毒性疾病。該病能導(dǎo)致母豬不孕、流產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎、畸胎或死胎、新生仔豬死亡，還能導(dǎo)致仔豬皮炎、腹瀉等。

2011年4月，湖南某規(guī)模豬場(chǎng)飼養(yǎng)的160頭母豬中60頭初產(chǎn)母豬，陸續(xù)表現(xiàn)流產(chǎn)，產(chǎn)死胎，木乃伊胎等。筆者對(duì)該場(chǎng)的母豬抽樣采血并進(jìn)行了豬瘟病毒抗體、藍(lán)耳病毒抗體以及偽狂犬的野毒抗體的檢測(cè)。此外還對(duì)流產(chǎn)死胎進(jìn)行了豬細(xì)小病毒的病原學(xué)檢測(cè)?，F(xiàn)報(bào)告如下：

1 材料

1.1 病料樣品

21 份母豬血液（1～10 號(hào)來(lái)自經(jīng)產(chǎn)母豬、11～21號(hào)來(lái)自初產(chǎn)母豬），3頭懷孕70天以內(nèi)流產(chǎn)的死胎。

1.2 主要試劑和試劑盒

檢測(cè)豬瘟病毒抗體、藍(lán)耳病毒抗體、偽狂犬野毒抗體的ELISA 試劑盒均為美國(guó)IDEXX 公司生產(chǎn)，PCR 試劑購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，瓊脂糖凝膠為鼎國(guó)公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 血清抗體的檢測(cè) 按試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。

2.2 細(xì)小病毒的PCR 檢測(cè)

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2.2.1 引物的設(shè)計(jì)和合成

參照GeneBank 上登陸的豬細(xì)小病毒基因序列(參考序列登陸號(hào)為EU790641)，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，特異性擴(kuò)增196bp 的DNA 片段。引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

2.2.2 PCR 檢測(cè)

取流產(chǎn)死胎的肝臟、肺臟，研磨成勻漿，按蛋白酶K、酚、氯仿的方法抽提，提取基因組后，用引物Fp1 和Rpl 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增豬細(xì)小病毒特異性片段，PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；進(jìn)入循環(huán)，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30s，進(jìn)行 35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。最后用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2.2.3 PCR 產(chǎn)物測(cè)序

將PCR 產(chǎn)物用純化試劑盒進(jìn)行清潔純化，純化后的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送北京華大生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序并將測(cè)出的序列進(jìn)行Blast 分析確定。

3 結(jié)果

3.1 血清抗體檢測(cè)結(jié)果

取21 份母豬血清分別進(jìn)行豬瘟病毒抗體（HCV Ab）、藍(lán)耳病毒抗體（PRRSV Ab）、偽狂犬野毒抗體（PRV Ab）3 個(gè)項(xiàng)目的檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2，由表2 可見(jiàn)21 份血清中有14 份為豬瘟抗體陽(yáng)性，其中經(jīng)產(chǎn)母豬的有7 份，初產(chǎn)母豬的有7 份；藍(lán)耳病毒抗體則所有樣本均為陽(yáng)性，21 份樣本中S/P 值均在2.0 以下；所有血清樣品偽狂犬野毒抗體均為陰性。

表2 中，豬瘟抗體判定標(biāo)準(zhǔn)：阻斷率≥40%為陽(yáng)性（+），阻斷率≤30%為陰性（-），30% ＜ 阻斷率＜40%為可疑（±）；藍(lán)耳病毒抗體判定標(biāo)準(zhǔn)：S/P值≥0.4 時(shí)為陽(yáng)性（+），S/P 值 ＜0.4 時(shí)為陰性（-）；偽狂犬野毒抗體判定標(biāo)準(zhǔn)：被檢樣品S/N≤0.6 為抗體陽(yáng)性（+）；S/N＞0.7 為抗體陰性（-）；0.6＜S/N≤0.7 為可疑（±）。

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3.2 PCR 檢測(cè)結(jié)果

以提取的豬細(xì)小病毒基因組為模板，用設(shè)計(jì)的豬細(xì)小病毒特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖1，由圖可見(jiàn)3 份病料樣本均擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符的片段。

3.3 測(cè)序結(jié)果

PCR 產(chǎn)物純化后送公司進(jìn)行1 個(gè)反應(yīng)的測(cè)序，共得到196bp 的準(zhǔn)確序列，進(jìn)行BLAST 分析發(fā)現(xiàn)該病毒確為豬細(xì)小病毒，序列如下：

GGACCATTAACAGCACTAAACAATACTGCACCTG TATTTCCAAATGGTCAAATATGGGATAAAGAACT TGATACAGATCTAAAACCTAGACTACATGTTACA GCTCCATTTGTTTGTAAAAACAATCCACCAGGAC AACTATTTGTAAAAATAGCACCAAACCTAACAG ATGATTTCAATGCTGACTCTCCTCAAC

4 討論

4.1 疫情診斷

該母豬群豬瘟抗體陽(yáng)性率66.67%，陰性率28.57%，可疑率4.76%；藍(lán)耳病毒抗體陽(yáng)性率為100%，且抗體水平S/P 值均在0.4～2.0 之間；偽狂犬野毒抗體均為陰性。從檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)該母豬群豬瘟抗體水平不理想，但由于表現(xiàn)流產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎的初產(chǎn)母豬有半數(shù)以上豬瘟抗體水平較好，抗體阻斷率值在60%以上，因此可以推斷該次疫情不是由豬瘟病毒引起，此外，母豬群藍(lán)耳病毒抗體均為陽(yáng)性且抗體水平比較整齊，目前該豬場(chǎng)應(yīng)該不屬于藍(lán)耳病毒感染活躍豬群；偽狂犬野毒抗體均為陰性，表明豬群中沒(méi)有偽狂犬野毒感染和流行。

取流產(chǎn)死胎進(jìn)行豬細(xì)小病毒的PCR 檢測(cè)并測(cè)序，結(jié)果表明在樣本中均能檢測(cè)到細(xì)小病毒基因，結(jié)合臨床癥狀可將該場(chǎng)出現(xiàn)的初產(chǎn)母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎確診為細(xì)小病毒感染造成。

4.2 豬場(chǎng)細(xì)小病毒病的防控

豬細(xì)小病毒病是導(dǎo)致母豬特別是初產(chǎn)母豬繁殖障礙的疾病之一，隨著規(guī)?；B(yǎng)殖的發(fā)展，母豬的健康和產(chǎn)仔率、仔豬成活率越來(lái)越成為養(yǎng)殖業(yè)的關(guān)鍵。筆者認(rèn)為，對(duì)于豬細(xì)小病毒病的防控應(yīng)做到以下幾點(diǎn)：一是引種要規(guī)范，杜絕引進(jìn)病豬和帶毒豬；二是初產(chǎn)母豬要主動(dòng)免疫后才能配種，后備公豬在配種前一個(gè)月應(yīng)進(jìn)行免疫接種；三是要建立規(guī)范、科學(xué)的免疫程序，定期進(jìn)行血清學(xué)監(jiān)測(cè)及時(shí)了解豬群免疫狀況；四是應(yīng)建立高標(biāo)準(zhǔn)的衛(wèi)生防疫和綜合防制措施，杜絕病毒的傳播和污染，促進(jìn)豬場(chǎng)健康發(fā)展。 □