C－反應蛋白基因多態(tài)性與腦梗死

鄧 可 肖志杰 黎肖弟

C-反應蛋白（C-reactive protein，CRP）是重要的急性期蛋白，作為經典的炎癥介質具有多種生理功能。炎癥在動脈粥樣硬化以及缺血事件的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。數個前瞻性研究顯示，單獨測量血清CRP水平可作為首發(fā)和再發(fā)腦血管事件的危險預測因子［1～3］。國外的大量研究證實CRP與種族相關，目前國內尚無相關試驗報道，本研究對此進行了研究，采用病例－對照研究，探討rs1205基因多態(tài)性和缺血性腦卒中的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 腦梗死組來源于2007年7月～2007年12月在中南大學湘雅二醫(yī)院神經內科急診室留觀或住院的中老年腦梗死患者105例，其中男75例，女30例；年齡37～92歲，平均年齡（64.1±11.4）歲；病程＜3 d；均符合全國第四屆腦血管病學術會議修訂的診斷標準，并經頭顱CT／MRI證實。根據美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表（NIHSS）評分，其中病情為輕度（NIHSS＜6）59例，中度（NIHSS6～13）36例，重度（NIHSS＞14）10例。體質量指數（BMI）24.12±6.40。伴有冠心病史30例，高血壓病史92例，糖尿病史25例；腦卒中家族史21例，吸煙史46例，飲酒史18例。對照組為121名同期門診體檢者，其中男73例，女48例；年齡45～80歲，平均年齡（62.5±9.2）歲；BMI 23.74±3.05。伴有冠心病史15例，高血壓病史28例，糖尿病史2例；腦卒中家族史2例，吸煙史16例，飲酒史8例。入組者排除伴隨腦出血、合并周圍血管疾病或周圍血管栓塞性疾病、大動脈炎、血液病、結核或明顯肺部感染、惡性腫瘤、嚴重肝腎功能不全者、曾接受器官移植者。腦梗死組和對照組在性別、年齡、BMI的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。常見的危險因素如冠心病史、高血壓病史、糖尿病史、腦卒中家族史、吸煙史及飲酒史腦梗死組明顯高于對照組（P均＜0.05）。

1.2 血清h-s CRP水平測定 所有入選對象（腦梗死患者在發(fā)病24 h內，部分患者在發(fā)病的3 d內）采集清晨空腹靜脈血2 ml，由本院檢驗科用Hitachi 7170A全自動生化分析儀，采用免疫透射比濁法測定超敏 C－反應蛋白（high-sensitive C reactive protein，h-s CRP）水平。

1.3 CRP基因型測定 取肘靜脈血5 ml，采用低滲溶血、酚／氯仿法抽提外周白細胞基因組DNA，TE溶解保存；多聚合酶鏈式反應（PCR）和限制性片段長度多態(tài)性測定rs1205基因多態(tài)性，引物由博尚生物技術有限公司合成（表1）。

25μl PCR反應體系：10×PCR緩沖液2.5μl，Mg2＋25 mM1μl，4×dNTP25 nM1μl，上游和下游引物分別為10μM1μl，基因組DNA1μl，Taq酶5μ／μl 0.5μl，二甲基亞砜（DMSO）2.5μl。擴增條件：95℃預變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸50 s，共35個循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存。限制性內切酶消化反應體系20μl：PCR產物10μl，10×Buffer R2μl，內切酶2 U 酶切，37℃消化14 h。以pUC19DNA／MspI酶解片斷作為DNA片斷的標準物，20%聚丙烯酰胺凝膠電泳后銀染（圖1）。

圖1 rs1205產物酶解片段20%聚丙烯酰胺凝膠電泳譜

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS13.0軟件包。多數計量資料近似正態(tài)分布，而CRP呈偏態(tài)分布，將其對數轉換為Log CRP，經Kolmogorov-Smirnov檢驗近似正態(tài)分布（Z＝0.988，P＝0.283）再行檢驗。計量資料以均數±標準差（±S）表示，組間比較采用t檢驗；分類資料采用卡方檢驗；采用Logistic回歸模型判斷腦梗死危險因素作用的大小，分別計算各自的比值比（OR）及其95%可信區(qū)間（CI）。

2 結 果

2.1 腦梗死組與對照組基因型比較 在研究總人群（腦梗死組＋對照組）中rs1205基因型的頻率分別為CC17.7%，CT48.2%，TT34.1%；等位基因C／T的頻率分別為0.418和0.582，符合 Hardy－Weinberg平衡（χ2＝0.018，P＝0.894）。腦梗死組和對照組的基因型及等位基因的分布趨勢相同，差異無顯著性（P＞0.05）（表2）。

表2 腦梗死組與對照組rs1205基因型的比較

2.2 CRP基因型對CRP水平的影響 rs1205的CC、CT、TT基因型的Log CRP水平分別為（0.357±0.669）、（0.252±0.597）、（0.165±0.636）Log mg／L，基因型的血清Log CRP水平呈逐一下降趨勢，但差異無顯著性（P＞0.05）（表3）。

2.3 CRP水平對腦梗死嚴重程度的影響 在對腦梗死患者入院后立即用美國國立衛(wèi)生院神經功能缺損評分（National Institues of Health Stroke Scale，NIHSS）將其分為3類：輕（NIHSS＜6）、中（6≤NIHSS≤13）及重（NIHSS≥14）。其中評分為重的h-s CRP和Log CRP水平均高于其他兩組，統(tǒng)計學有顯著性差異（P＜0.05）（表4）。

表3 CRP基因型對CRP的影響（±s）

表3 CRP基因型對CRP的影響（±s）

基因型 Log CRP（Log mg／L） P值rs1205 CC 0.357±0.669 0.309 CT 0.252±0.597 TT 0.165±0.636

表4 CRP水平對腦梗死嚴重程度的影響（±s）

表4 CRP水平對腦梗死嚴重程度的影響（±s）

注：與NIHSS輕、中組比較，＊P＜0.05

CRP水平 h-s CRP（mg／L）（中位數）Log CRP（Log mg／L）（images/BZ222.png±s）50中組（6≤NIHSS≤13）（n＝36） 4.06 0.52±0.67重組（NIHSS≥14）（n＝10） 28.99＊ 0.90±0.80輕組（NIHSS＜6）（n＝59） 2.91 0.43±0.＊

2.4 CRP基因型對腦梗死嚴重程度的影響 將腦梗死rs1205基因型與NIHSS評分制表如下，經χ2檢驗，rs1205基因型與腦梗死嚴重程度均無關聯，統(tǒng)計學無顯著性差異（P＞0.05）（表5）。

將三種基因型進行DNA序列測定。由測序圖譜可以看出，CRP1846C＞T的PCR擴增產物序列CC型中的堿基C（圖2－1中箭頭所指）突變?yōu)門T型中的T（圖2-3中箭頭所指），這與酶切結果一致（圖2）。

表5 CRP基因型×NIHSS交叉表

3 討 論

動脈粥樣硬化作為腦梗死的基因病因，越來越多的證據表明它是一個慢性炎性的過程。多個研究發(fā)現，年齡、性別、體重等多個臨床相關指標影響血清CRP 水平［4，5］。rs1205單核苷酸多態(tài)性是 CRP常見多態(tài)性之一，位于3′-UTR區(qū)域。rs1205對h-s CRP水平影響的研究結果大相徑庭［6，7］。本研究發(fā)現攜帶rs1205T等位基因的人群血清h-s CRP水平下降，但與CRP水平無顯著關聯。這可能與CRP的變化由多個因素影響，且遺傳影響較低［8］有關。

圖2 CRP1846C＞T PCR產物測序圖譜

rs1205在不同種族和地區(qū)的分布不同。通過對PUBMED SNP數據庫檢索獲得，rs1205T等位基因在歐洲人的分布頻率為0.333；在非洲人群中為0.150；在中國北京地區(qū)為0.556。在本研究中中國湖南漢族健康人群中rs1205單核苷酸多態(tài)性位點有CC、CT、TT三種基因型；T等位基因頻率分別為0.579。等位基因T的分布頻率明顯高于歐洲人群而與中國北京人群分布相似。由此可見T等位基因在不同種族的分布可存在差異。

許多研究都證實，CRP水平與缺血性腦卒中的發(fā)病相關［9，10］。而關于CRP基因多態(tài)性與缺血性腦卒中的關系卻存在爭議。Morita A等檢測了4個人類 CRP基因SNP基因型：rs1341665，rs1800947，rs1130864，rs1205后發(fā)現僅rs1800947與缺血性腦卒中有顯著關聯［11］。Kuhlenbaeumer G［12］等對4個SNPs（rs3093075，rs1205，rs1130864，rs1800947）研究發(fā)現，沒有相關的SNP位點或SNP單體型與整體的缺血性腦卒中相關，但三個單核苷酸多態(tài)性（rs3093075，rs1130864和rs1800947）與微血管閉室呈顯著的關聯。Wang Q等的研究沒有發(fā)現rs1205與缺血性腦卒中相關，但單體型H3與缺血性腦卒中相關。本研究沒有對腦卒中類型進行細分及構建單體型，研究發(fā)現重型腦梗死患者的hsCRP水平顯著高于輕、中度組，rs1205基因型與腦梗死及腦梗死病情的嚴重程度均無關，與之前的結果一致。

本研究采用病例－對照配比研究，標本量偏?。槐狙芯繘]有對腦卒中進行細分研究，研究結果與他人有差異，但可能與樣本選擇、種族差異等有關，有必要擴大樣本量、多地區(qū)間進行比較，以進一步探討。

1 Arenillas JF，Alvarez-Sabin J，Molina CA，et al.C-reactive protein predicts further ischemic events in first-ever transient ischemic attack or stroke patients with intracranial large-atrery occlusive disease.Stroke，2003，34（10）：2463-2468.

2 Di NM，Papa F，Bocola V.Prognostic influence of increased C-reactive protein and fibrinogen levels in ischemic stroke.Stroke，2001，32（1）：133-138.

3 Di NM，Schwaninger M，Cappelli R，et al.Evaluation of C-reactive protein measurement for assessing the risk and prognosis in ischemic stroke：a statement for health care profesionals from the CRP Pooling Project members.Stroke，2005，36（6）：1316-1329.

4 Kathiresan S，Larson MG，Vasan RS，et al.Contribution of clinical correlates and 13 C-reactive protein gene polymorphisms to interindividual variability in serum C-reactive protein level.Circulation，2006，113（11）：1415-1423.

5 Ridker PM，Fonseea FS，Genest J，et al.Baseline characteristions of participants in the JUPITER trial.a randomized placebo-controlled primary prevention trial of statin therapy among individuals with low low-density lipoprotein cholesterol and elevated high-sensitivity C-reactive protein.Am J Cardiol，2007，100（11）：1659-1664.

6 Lee CC，You NC，Song Y，et al.Relation of genetic variation in the gene coding for C-reactive protein with its plasma protein concentrations：findings from the Women′s Health Intiative Observational Cohort.Clin Chem，2009，55（2）：351-360.

7 Teng MS，Hsu LA，Wu S，et al.Association between C-reactive protein gene haplogypes and C-reactive protein levels in Taiwanese：interaction with obesity.Atherosclerosis，2009，204（2）：e64-69.

8 Su S，Lampert R，Zhao J，et al.Pleiotyopy of C-reactive protein gene polymorphisms with C-reactive protein levels and heart rate variability in healthy male twins.Am J Cardiol，2009，140（12）：1748-1754.

9 鄧 可，肖志杰，趙水平，等.血清超敏C-反應蛋白水平及CRP 1059G／C基因多態(tài)性與腦梗死的相關性.臨床神經病學雜志，2009，（6）：413-415.

10 Wang Q，Ding H，Tang JR，et al.C-reactive protein polymorphisms and genetic susceptibility to ischemic stroke and hemorrhagic stroke in the Chinese Han population.Acta Pharmacol Sin，2009，30（3）：291-298.

11 Morita A，Nakayama T，Soma M.Association study between C-reactive protein genes and ischemic stroke in Japanese subject.Am J Hypertens，2006，19（6）：593-560.

12 Kuhlenbaeumer G，Huge A，Berger K，et al.Genetic variants in the C-reactive protein gene are associated with microangiopathic ischemic stroke.Cerebrovase Dis，2010，30（5）：476-482.