長期遞增負荷運動對調(diào)控骨髓B細胞發(fā)育分化的E2A、EBF、PAX5的影響

耿青青

運動免疫學研究已證實，運動員長期從事大強度的運動訓練，會發(fā)生強烈的運動性免疫失衡現(xiàn)象?，F(xiàn)有研究多從外周免疫細胞的失衡、失調(diào)入手探討機理，本研究結合課題組前期研究成果［1-6］，推斷雖然這些現(xiàn)象出現(xiàn)在血液，但根源可能在淋巴細胞的發(fā)生源頭骨髓，即運動應激通過影響骨髓造血微環(huán)境中各種調(diào)控因子進而影響了淋巴細胞的發(fā)育異常。

B細胞發(fā)育過程中有許多特征性的基因表達，這些特定基因的表達是由眾多的轉錄因子調(diào)節(jié)的。轉錄因子啟動不同譜系特異基因的表達，保證發(fā)育分化過程中向某一譜系分化時失去向其他譜系分化的潛能。影響B(tài)細胞早期發(fā)育的轉錄因子主要調(diào)節(jié)著2個關卡，即共同淋巴樣祖細胞向B細胞譜系發(fā)育和祖B細胞向前B細胞發(fā)育。目前已知PU.1和Ikaros在第一個關卡起作用，而E2A、EBF和BSAP／PAX5可能在第二個關卡起作用，這些轉錄因子的等級性調(diào)節(jié)可能是獲取B細胞前體B系特異性的關鍵。

研究者前期實驗研究證明，6周遞增運動過程中，機體根據(jù)運動需要，通過改變凋亡率，進而改變早期發(fā)育中B細胞的數(shù)量百分比，以求盡可能維持免疫穩(wěn)態(tài)；“運動性免疫抑制”最初是針對T細胞發(fā)育分化調(diào)節(jié)而言的，經(jīng)過前期工作總結后，研究者認為，針對B細胞、T細胞等免疫細胞的發(fā)育分化調(diào)節(jié)而言，稱為“運動性免疫失衡”會更準確、全面［1-6］。那么，在6周遞增運動過程中，對于早期B細胞發(fā)育起著關鍵調(diào)控作用的因子，如轉錄因子，細胞因子和趨化因子等，在6周遞增負荷運動中產(chǎn)生了怎樣的適應性及應答性變化？它們之間以及與Pro B細胞、Pre B細胞又有著怎樣的等級性調(diào)節(jié)？

基于此，在前期長期遞增負荷對早期B細胞在骨髓中發(fā)育影響的基礎上，根據(jù)B細胞發(fā)育第二關卡理論，分析6周遞增負荷運動對轉錄因子的影響及其與Pro B細胞、Pre B細胞的相關關系，探討長期運動對骨髓早期B細胞發(fā)育的調(diào)節(jié)機制。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

雄性SD大鼠128只，8周齡，體重130～150g［許可證號:SCXK（粵）2008-0020；NO:0043379，粵 監(jiān) 證 字F2008A002］。隨機分為實驗組和對照組（表1），實驗組（96只）進行6周遞增強度訓練；絕對安靜組（對照組，32只）正常喂養(yǎng)，不進行運動干預，分別于第0、2、4、6周末采樣，用于判別大鼠生長對測試指標的影響（實驗組實際參與運動的大鼠是106只，以備補充建模中意外死亡大鼠，本次建模因意外死亡大鼠2只）。

表1 本研究實驗對象分組情況一覽表 （只）Table 1 Grouping of Animals

1.2 運動模型設計、取材時間及建模測試指標

參照Bedfor d（1979）根據(jù)大鼠體重／耗氧量回歸方程所建立的遞增負荷（跑臺坡度），課題組前期研究建立了運動性免疫失衡發(fā)生、發(fā)展的動物模型［7-12，15，16］:模擬 運動訓練安排，長時間、高密度、大強度且負荷遞增，進行持續(xù)6周的遞增負荷運動，每次運動30min；適應性運動訓練1周后，起始負荷定為20m／min，每周遞增負荷5m／min，至第6周達40m／min，到達大鼠最大強度負荷（表2）。

取材時間:第0周末，即運動訓練前，完成1個定量運動負荷（10m／min），分別在運動前安靜狀態(tài)、運動后即刻和運動后3h取材。第2、4、6周末訓練完成后，休息1天，次日（大鼠運動后恢復48h）完成同周相同定量運動負荷，分別在運動前安靜狀態(tài)、運動后即刻和運動后3h取材。對照組正常喂養(yǎng)，不運動，分別于第0、2、4、6周末處死，測試相同指標，用于判別大鼠生長對這些指標的影響。

無菌取得大鼠（股骨）骨髓和股骨（含骨髓）。大鼠骨髓直接用錫紙包好放在液氮中，用于mRNA和蛋白表達的研究；股骨則放入10%中性甲醛固定液內(nèi)固定，用于股骨脫鈣石蠟免疫組織化學檢測。

前期課題組成員已分別測試血液、T細胞活性、巨噬細胞吞噬能力、神經(jīng)遞質(zhì)等指標，并監(jiān)測大鼠體重、皮毛亮度等指標，通過比較對照組與訓練組的差異，驗證大鼠6周遞增負荷跑臺運動性免疫失衡發(fā)生、發(fā)展的運動模型的建 立 是 成 功 的［7-12，15，16］。

表2 本研究運動訓練負荷方案一覽表Table 2 Protocol of Training in Rats （m／min）

1.3 要試劑、儀器及實驗步驟

1.3.1 股骨脫鈣免疫組織化學技術

1）室溫固定24h后，股骨放入EDTANa2液中脫鈣，換液每3天1次，約2月后，針刺無阻即為脫鈣完成；2）取股骨骨干和股骨頭的結合部做成蠟塊，股骨組織做4μm連續(xù)切片；3）常規(guī)脫臘至水；4）高壓抗原修復，PBS洗；5）3%H2O2室溫孵育15min，PBS洗；6）加 PAX5抗體（Sata cruz，sc-1974，1∶10稀釋），4℃過夜，PBS洗；7）滴加二抗，37℃孵育20min，PBS洗；8）DAB顯色劑鏡下觀察顯色；9）蘇木素復染核；10）脫水，透明，封片，其中，用PBS代替一抗作為空白對照。

1.3.2 Real time RT-PCR

采 用 SYBR Green I檢 測 法。RNAiso Plus、SYBR○RPremix Ex TaqTMⅡ、PrimeScriptTMRT reagent Kit均購自寶生物工程（大連）有限公司（產(chǎn)品貨號分別是:D9108B、DRR081A、DRR037A）。

具體步驟:引物設計、樣本采集、總RNA的抽提（RNA的沉淀、清洗、溶解、貯存等）、總RNA樣品濃度分析及純度測定、反轉錄反應、Real Time PCR反應、樣品目的基因的相對表達量的獲取。

引物由TAKARA寶生物工程（大連）有限公司合成（表3），用無菌去離子水稀釋為10μM濃度的工作液，分裝貯存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 Western Blot

E2A購自 Abcam（貨號:ab69999，1∶800稀釋）、EBF購自Sata cruz（貨號:sc-137065，1∶400稀釋）。主要步驟:SDS-PAGE電泳、轉膜、膜的封閉、抗體雜交、顯色（ECM）、結果檢測。

表3 本研究E2A、EBF、PAX5的引物情況一覽表Table 3 Gene-specific Primers of E2A，EBF，PAX5

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 研究結果

2.1 6周遞增負荷運動中骨髓轉錄因子E2A、EBF（WB）及PAX5（IHC）蛋白表達的變化

本研究6周遞增負荷運動中各組骨髓轉錄因子E2A、EBF（WB）蛋白表達見圖1，各組骨髓PAX5蛋白表達見圖2。對照組（絕對安靜組）各指標各周之間沒有顯著性差異（P＞0.05），表明6周生長對這些指標沒有顯著影響，下同。6周遞增負荷運動過程中，E2A、EBF及PAX5蛋白表達的變化特征（表4～表6）:第0周，各組間E2A、EBF、PAX5蛋白表達均無顯著性差異（P＞0.05）。第2周，與A組相比，J組E2A、EBF蛋白表達均顯著性下降（P＜0.05），3H組E2A、EBF蛋白表達組不具顯著性差異（P＞0.05），但PAX5呈顯著性上升（P＜0.05）；與J組相比，3H組E2A、EBF均不具顯著性差異（P＞0.05），PAX5顯著性上升（P＜0.05）。第4周，與A組相比，EBF蛋白表達在J組有非常顯著性下降（P＜0.01），3H組有顯著性上升（P＜0.05），而 E2A、PAX5在J組、3H 組均無顯著性差異（P＞0.05）；與J組相比，3H 組EBF、PAX5均有顯著性上升（P＜0.05）。第6周，與A組相比，J組E2A、EBF蛋白表達均不具顯著性差異（P＞0.05），PAX5在3H組有顯著性上升（P＜0.05）；與J組相比，3H 組E2A、PAX5均呈顯著性上升（P＜0.05）。

2.2 6周遞增負荷運動過程中E2A、EBF及PAX5基因表達的變化

表7～表9顯示:第0周，各組間E2A、PAX5基因表達均無顯著性差異（P＞0.05）；與A組相比，J組EBF基因表達呈現(xiàn)顯著性下降（P＜0.05），3H有上升趨勢，但無顯著性差異（P＞0.05）。第2周，與A組相比，J組E2A、EBF、PAX5基因表達均顯著性下降（P＜0.05），3H 組僅EBF具顯著性低下（P＜0.05）；與J相比，3H 組 E2A、PAX5均具顯著性上升（P＜0.05），EBF不具顯著性差異（P＞0.05）。第4周，與 A組相比，EBF、PAX5基因表達在J組有顯著性下降（P＜0.05），3H組無顯著性變化（P＞0.05），而 E2A 在J組、3H組均無顯著性差異（P＞0.05）；與J組相比，3H 組PAX5有顯著性上升（P＜0.05）。第6周，與A組相比，J組E2A、EBF、PAX5基因表達均顯著性下降（P＜0.05），3H 組E2A、EBF均無顯著性變化（P＞0.05），僅PAX5有顯著性下降（P＜0.05）；與J組相比，3H 組E2A、EBF、PAX5均無顯著性差異（P＞0.05）。注:＊、＊＊表示同周與AC組比較時P＜0.05、P＜0.01；﹟、﹟﹟表示同周A組比較時P＜0.05、P＜0.01；▲、▲▲表示同周與J組比較時P＜0.05、P＜0.01，下同。

圖1 本研究6周各組大鼠骨髓轉錄因子EBF、E2A蛋白表達示意圖Figure 1.Protein Expression of E2A，EBF（WB）in Bone Marrow for Six Weeks

圖2 本研究6周各組大鼠骨髓PAX5蛋白表達示意圖（石蠟組化切片，×400）Figure 2.Protein Expression of PAX5（IHC）in Bone Marrow for Six Weeks

表4 本研究骨髓轉錄因子E2A蛋白表達一覽表（Western Blot）Table 4 Changes of E2Ain Bone Marrow（Western Blot）

表5 本研究骨髓轉錄因子EBF蛋白表達一覽表（Western Blot）Table 5 Changes of EBF in Bone Marrow（Western Blot）

表6 本研究骨髓轉錄因子PAX5蛋白表達一覽表（免疫組化IOD值，×104）Table 6 Changes of IOD of PAX5in Bone Marrow（IHC，×104）

表7 本研究骨髓轉錄因子E2AmRNA表達一覽表Table 7 Changes of E2AmRNA in Bone Marrow

表8 本研究骨髓轉錄因子EBF mRNA表達一覽表Table 8 Changes of EBF mRNA in Bone Marrow

表9 本研究骨髓轉錄因子PAX5mRNA表達一覽表Table 9 Changes of PAX5mRNA in Bone Marrow

2.3 轉錄因子蛋白表達與骨髓B系發(fā)育各階段細胞群的相關性

表10顯示，E2A蛋白表達與Pro B、Pre B的相關性分別為0.76、0.67；EBF蛋白表達與 Pro B、Pre B的相關性分別為0.82、0.89；PAX5蛋白表達與Pro B、Pre B的相關性分別為0.81、0.87。

表10 本研究E2A、EBF、PAX5蛋白表達與Pro B、Pre B細胞群的多元線性回歸分析一覽表Table10 E2A，EBF，PAX5Protein Expression in Multiple Linear Regression Analysis with Pro B，Pre B populations（r）

2.4 轉錄因子基因表達與骨髓B系發(fā)育各階段細胞群的相關性

表11顯示，EBFmRNA與Pro B、Pre B的相關性分別為0.89、0.92；E2AmRNA與Pro B、Pre B的相關性分別為0.65、0.56；PAX5mRNA 與 Pro B、Pre B的相關性分別為0.76、0.84。

表11 本研究E2A、EBF、PAX5基因表達與Pro B、Pre B細胞群的多元線性回歸分析一覽表Table 11 E2AmRNA，EBF mRNA，PAX5mRNA in Multiple Linear Regression Analysis with Pro B，Pre B Cell Populations（r）

3 討論

機體具有連續(xù)生成新生血細胞以補充已分化成熟的衰老血細胞的維持造血動態(tài)平衡的能力，這就需要對血細胞的生成進行精密的調(diào)節(jié)控制。骨髓中的B淋巴細胞由造血干細胞接受分化信號后定向分化形成。

3.1 EBF、PAX5對發(fā)育中Pro B、Pre B細胞數(shù)量起主導調(diào)控作用

轉錄因子，如E2A，EBF和PAX5專一性地在B細胞譜系中進行調(diào)節(jié)。在缺失E2A基因的小鼠中，只影響B(tài)細胞發(fā)育，而包括T淋巴細胞在內(nèi)的其他造血細胞和非造血細胞系卻沒有明顯異常，此類小鼠體內(nèi)RAG-1、mbl、CD19、λ5和PAX-5轉錄消失，Ig重鏈V（D）J重排完全阻止，細胞發(fā)育停止在原B細胞［17］。E2A和EBF的協(xié)同作用對啟動B細胞的分化是必需的，通過調(diào)節(jié)B細胞的特異基因，如RAG-1，RAG-2（重組過程與以上基因的表達相關）、替代性輕鏈（λ5／VPre-B）、CD19、Igα（mb-1，CD79a）和Igβ（B29，CD79b）的表達而實現(xiàn)［18］。骨髓原 B細胞分化階段，PAX5能抑制T細胞定型關鍵基因Notchl的表達，抑制T細胞發(fā)育程序，PAX5高表達以促進B細胞發(fā)育，從而保證B細胞的特異性［19］。

Pro B細胞、Pre B細胞是淋巴樣干細胞中的一部分，在骨髓內(nèi)繼續(xù)分化成B細胞需經(jīng)歷的非抗原依賴階段的2個亞群，在整個B細胞發(fā)育過程中Pro B細胞、Pre B細胞有許多特征性的基因表達。

Pro B細胞是B細胞發(fā)育過程中重輕鏈基因尚未發(fā)生重排的胚系狀態(tài)，在骨髓基質(zhì)信號誘導刺激下，細胞表達RAG-1，RAG-2，以及編碼替代性輕鏈λ5和Vpre-B。

μ鏈在B細胞發(fā)育中起重要作用，因為μ鏈缺陷小鼠其B細胞發(fā)育阻滯在Pre B細胞階段。Pre-BCR由μ鏈、替代輕鏈 Vpre-B／λ5、Igα／β組成，雖然 Pre B細胞識別的配體尚不清楚，但此階段是B細胞發(fā)育中一個重要的關卡點。

EBF以同源二聚體的形式結合DNA，調(diào)節(jié)在B細胞發(fā)育中起重要作用的基因的表達，如λ5，VpreB和mb-1（Igα）。剔除EBF的小鼠體內(nèi)，完全缺失成熟B細胞，B細胞的發(fā)育中斷在免疫球蛋白DH-JH重排前的Pro B細胞［23］。在 EBF-／-Pro B細胞中，PU.1和E2A基因表達，但檢測不到PAX5的轉錄，提示EBF受E2A的調(diào)控，先于PAX5在B細胞發(fā)育早期發(fā)揮作用。

在Pro B細胞向Pre B細胞分化過程中，EBF和E47（E2A）能協(xié)同誘導Pro B、Pre B細胞免疫球蛋白替代輕鏈λ5和Vpre-B的表達，通過調(diào)節(jié)RAG-1，RAG-2來控制V（D）J重組。

由此可見，6周遞增負荷運動過程中，E2A受運動的影響波動幅度較小，而EBF、PAX5則波動幅度較大。EBF、PAX5蛋白與骨髓Pro B、Pre B細胞數(shù)［1，2］有較高的相關系數(shù)，再次提示轉錄因子EBF、PAX5對發(fā)育中Pro B、Pre B細胞數(shù)量起主導調(diào)控作用。

3.2 EBFmRNA對早期B細胞發(fā)育的主導調(diào)控作用更加關鍵

在6周遞增負荷運動過程中，僅特異轉錄因子的EBF蛋白表達水平與EBF基因表達有較相似的趨勢，E2A、PAX5基因轉錄與蛋白表達不同步，推測其可能原因是:基因表達對蛋白質(zhì)合成只是具有指導性合成的作用，影響蛋白質(zhì)表達除了此因素，還與合成酶的活性、合成底物的充足與否等多種因素有關。此外，還可能涉及基因轉錄后調(diào)控機制，有待進一步研究證實。

研究結果顯示，EBFmRNA在一次性運動后即有顯著的應答反應，即EBF基因的轉錄對運動刺激更為敏感，短時間的運動即可以誘導其表達。EBFmRNA與Pro B、Pre B有更高的相關系數(shù)（表11），再次提示EBFmRNA對B細胞發(fā)育的主導調(diào)控作用更關鍵。

有研究［20-22］認為，E2A主要調(diào)控EBF的表達，E2A與EBF再進一步調(diào)控PAX5的表達。本研究中結果顯示，在運動的影響下，對早期B細胞發(fā)育的起特異轉錄調(diào)控作用的因子中，EBF比上級調(diào)控因子E2A和下游調(diào)控因子PAX5作用更為突出。

前期研究顯示，PU.1、E2A、EBF、PAX5在B細胞的分化中有等級性調(diào)節(jié)關系。如PU.1正性調(diào)節(jié)EBF的表達，而在造血前體細胞，加強的EBF表達能夠恢復在PU.1缺失時受損B細胞的發(fā)育。PAX5是EBF的靶基因，但異位的PAX5并不能恢復在PU.1缺失時B細胞的發(fā)育。此外，EBF在抑制非B系細胞如T細胞和髓樣細胞中起了重要作用。

EBF表達的調(diào)節(jié)，對B細胞發(fā)育的早期階段，如共同淋巴樣前體（CLP）和Pre-pro B（前祖B細胞）細胞階段，起到了關鍵的系譜特異定型的作用，即導向性的指引未定型的多能淋巴系干細胞前體向B細胞系譜分化。研究表明，EBF在無PAX5存在時，可以限制淋巴系干細胞向B系細胞的分化并促進B系細胞定型［21］。

Seet CS等［22］發(fā)現(xiàn)，在阻止E2A的表達并伴隨IL-7的低刺激的條件下，EBF也能夠起到促進B細胞增殖的關鍵作用。他們發(fā)現(xiàn)缺失E2A基因小鼠，被阻斷的B細胞增殖可以因EBF的表達而非PAX5的表達而得到修復，通過促成絕大多數(shù)B細胞系譜基因的表達而實現(xiàn)，提示在早期B系細胞的發(fā)育中，EBF是E2A不可缺少的靶基因。

也有研究［20］進一步發(fā)現(xiàn)，由于E2A利于N-myc的表達，E2A蛋白對于依賴IL-7的細胞增殖也是必需的，因此，高濃度的E蛋白對于EBF和N-myc的激活是必須的；而低濃度的E蛋白，在其他B系轉錄因子如EBF的表達的協(xié)同下，也能夠發(fā)揮促進大多數(shù)B系細胞基因表達的作用。

如圖3所示，本課題研究希望進一步通過組織學觀察、細胞水平、轉錄因子、細胞因子及其受體、趨化因子及其受體、Notch信號轉導通路等的層面進一步探討運動性免疫失衡的調(diào)控機制及干預措施。

圖3 本研究實驗各指標在第2周的變化及相互關聯(lián)示意圖Figure 3.The Response and Correlating of Laboratoy Indexes at WK2

4 結論與建議

1.6周遞增負荷運動過程中，E2A受運動的影響波動幅度較小，而EBF、PAX5則波動幅度較大。EBF、PAX5蛋白與骨髓Pro B、Pre B細胞數(shù)的相關度，再次提示轉錄因子EBF、PAX5對發(fā)育中Pro B、Pre B細胞數(shù)量起主導調(diào)控作用。

2.E2A、PAX5的蛋白與基因表達不同步，提示基因表達對蛋白質(zhì)只是具有指導性合成的作用，還可能涉及基因轉錄后調(diào)控機制，有待進一步研究證實。

3.EBFmRNA在WK0呈現(xiàn)波動，提示EBF基因的轉錄對運動刺激更為敏感，并發(fā)現(xiàn)EBF比上級調(diào)控因子E2A和下游調(diào)控因子PAX5對B細胞發(fā)育的主導調(diào)控作用更加關鍵，對研究運動性免疫調(diào)理、延緩疲勞的意義重大。

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