多菌復(fù)合饅頭發(fā)酵劑工業(yè)培養(yǎng)基的優(yōu)化

張春輝，孫慶申，2，吳 桐，2，李 冰，韓德權(quán)，2

（1．黑龍江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 微生物黑龍江省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080；2．農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱 150500）

當(dāng)今，復(fù)合發(fā)酵劑應(yīng)用十分廣泛。大多集中于酸奶發(fā)酵、香腸發(fā)酵和飼料發(fā)酵［1－3］等領(lǐng)域，所有關(guān)于復(fù)合面食發(fā)酵劑的研究報道幾乎全部都是由各菌種單獨(dú)培養(yǎng)后混合而成［4－6］，而并不是混合培養(yǎng)［7］。加之，實(shí)驗(yàn)室研究使用昂貴藥品配制培養(yǎng)基，不切合復(fù)合饅頭發(fā)酵劑工業(yè)化生產(chǎn)的實(shí)際。本試驗(yàn)以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，運(yùn)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對多菌復(fù)合饅頭發(fā)酵劑混合培養(yǎng)工業(yè)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得最佳的工業(yè)培養(yǎng)基配方。

1 材料與方法

1．1 材 料

1．1．1 菌 種

面包酵母 （Saccharomyces cerevisiae）和副干酪乳桿菌 （Lactobacillus paracasei）：本實(shí)驗(yàn)室分離；嗜酸乳桿菌 （Lactobacillus acidophilus）：黑龍江大學(xué)食品科學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；異常漢遜酵母（Hanseula anomala）：菌種編號2．592，購于中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1．1．2 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基：按照文獻(xiàn) ［8］的方法配制，121℃滅菌20min備用。

YEPD－溴甲酚綠固體培養(yǎng)基：酵母粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，瓊脂2%，溴甲酚綠0．01 mg／L。112℃滅菌20min。

1．2 方 法

1．2．1 培養(yǎng)方法

混合培養(yǎng)工藝［9］。

1．2．2 測定方法

總生物量測定：混合培養(yǎng)后，利用分光光度計(jì)在550nm處測定吸光值，間接反映總生物量。

培養(yǎng)基殘?zhí)菧y定：蒽酮比色法［10］。

面包酵母計(jì)數(shù)：稀釋平板計(jì)數(shù)法，無菌水稀釋適當(dāng)倍數(shù)，取0．1mL涂YEPD－溴甲酚綠平板，37℃培養(yǎng)，計(jì)數(shù)面包酵母菌落。

1．2．3 優(yōu)化方法

以玉米粉糖化液為碳源、豆粕粉水解液為有機(jī)氮源、硫酸銨為無機(jī)氮源、玉米漿作生長因子，采用單因素法和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)［11－12］優(yōu)化多菌復(fù)合饅頭發(fā)酵劑混合培養(yǎng)工業(yè)培養(yǎng)基。

1．2．3．1 碳源最適濃度范圍選擇試驗(yàn)

以1%豆粕水解液和0．3%硫酸銨作混合氮源，添加 0%、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%的玉米粉糖化液作碳源，0．5%玉米漿配制培養(yǎng)基，調(diào)初始pH＝6．0，滅菌。根據(jù)文獻(xiàn) ［9］培養(yǎng)工藝操作，對面包酵母菌落計(jì)數(shù)，確定玉米粉糖化液最適濃度范圍。

1．2．3．2 氮源最適濃度范圍選擇試驗(yàn)

1）豆粕水解液作有機(jī)氮源。用已確定的玉米粉糖化液添加量，以豆粕水解液作有機(jī)氮源，添加量為0%、2%、4%、6%、8%、10%，硫酸銨0．3%，玉米漿0．5%配制培養(yǎng)基，調(diào)初始pH＝6．0。根據(jù)文獻(xiàn) ［9］培養(yǎng)工藝操作，對面包酵母菌落計(jì)數(shù)，確定豆粕水解液最適濃度范圍。

2）硫酸銨作為無機(jī)氮源。用已確定的玉米粉糖化液添加量，以0%、0．25%、0．5%、0．75%、1%、1．25%硫酸銨作無機(jī)氮源，玉米漿0．5%，豆粕水解液按試驗(yàn)確定濃度添加，配制培養(yǎng)基，調(diào)初始pH＝6．0。根據(jù)文獻(xiàn) ［9］培養(yǎng)工藝操作。對面包酵母菌落計(jì)數(shù)，以確定硫酸銨最適濃度范圍。

1．2．3．3 玉米漿最適濃度范圍選擇試驗(yàn)

用試驗(yàn)已確定的碳氮源濃度，用0%、0．5%、1%、1．5%、2%的玉米漿作生長因子，調(diào)初始pH＝6．0。根據(jù)文獻(xiàn) ［9］培養(yǎng)工藝操作，對面包酵母菌落計(jì)數(shù)以確定玉米漿濃度范圍。

1．2．3．4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化工業(yè)培養(yǎng)基

根據(jù)前期單因素試驗(yàn)，優(yōu)選各因素3個水平采用4因素3水平 ［L9（34）］正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

表1 正交設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal design／%

2 結(jié)果與分析

2．1 單因素法確定各因素最適濃度范圍

2．1．1 碳源最適濃度范圍選擇

圖1中，當(dāng)濃度為12%和14%時的面包酵母生物量分別為 （6．8±0．136 5）×108cfu／mL和 （6．8±0．215 0）×108cfu／mL，p＝0．767 （p＞0．05），說明玉米粉糖化液濃度12%和14%對面包酵母生物量影響不顯著，故選擇玉米粉糖化液濃度為12%。

2．1．2 氮源最適濃度范圍選擇

2．1．2．1 豆粕水解液作有機(jī)氮源

圖1 玉米粉糖化液濃度對面包酵母生物量影響Fig．1 Effect of the corn saccharification solution concentrations on the biomass of saccharomyces cerevisiae

圖2中，隨著豆粕水解液濃度的增加，面包酵母的生物量變化不明顯。當(dāng)濃度為0%和2%時的面包酵母生物量分別為 （3．4±0．18）×108cfu／mL和 （4．0±0．096）×108cfu／mL，p＝0．023（p＜0．05），說明豆粕水解液濃度0%和2%對面包酵母生物量影響顯著。因此，選擇豆粕水解液濃度2%進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖2 豆粕水解液濃度對面包酵母生物量的影響Fig．2 Effect of the soybean meal hydrolyzate concentrations on the biomass of saccharomyces cerevisiae

2．1．2．2 硫酸銨作無機(jī)氮源

硫酸銨添加量與面包酵母生物量關(guān)系見圖3，隨著硫酸銨添加量的增加，面包酵母生物量隨之增加，添加量為1．0%和1．25%時的面包酵母生物量分別 為 （5．8±0．13）×108cfu／mL 和 （5．8±0．19）×108cfu／mL ，p＝0．981 （p＞0．05），說明硫酸銨1．0%和1．25%的添加量對面包酵母生物量影響不顯著，故選擇硫酸銨添加量為1．0%。

2．1．3 玉米漿最適濃度范圍選擇

由圖4可見，隨著玉米漿濃度的增加，面包酵母生物量隨之增加，當(dāng)濃度為1%和1．5%時的面包酵母生物量分別為 （3．9±0．105 4）×108cfu／mL和 （4．0±0．113 7）×108cfu／mL，p＝0．518（p＞0．05），說明玉米漿濃度在1%和1．5%時對面包酵母生物量影響不顯著，故選擇玉米漿濃度1%。

2．2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化工業(yè)培養(yǎng)基

通過單因素試驗(yàn)確定各因素的濃度，在此基礎(chǔ)上選擇合適的水平進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

由表2可見，各因素對混菌吸光值即總生物量的影響次序?yàn)椋河衩追郏径蛊桑居衩诐{＞硫酸銨，其最優(yōu)組合為A3B3C2D1，即玉米粉糖化液13%，豆粕水解液3%，硫酸銨1%，玉米漿0．8%。以面包酵母生物量作為評判標(biāo)準(zhǔn)，各因素對面包酵母生物量的影響次序?yàn)椋河衩追郏居衩诐{＞硫酸銨＞豆粕，其最優(yōu)組合為A3B3C2D1，即玉米粉糖化液13%，豆粕水解液3%，硫酸銨1%，玉米漿0．8%。另外明顯地，玉米粉糖化液和玉米漿對面包酵母生物量具有顯著影響。以殘?zhí)亲鳛樵u判標(biāo)準(zhǔn)，各因素對殘?zhí)堑挠绊懘涡驗(yàn)椋河衩追郏径蛊桑玖蛩徜@＞玉米漿，其最優(yōu)組合為A3B3C1D1，即玉米粉糖化液13%，豆粕水解液3%，硫酸銨0．9%，玉米漿0．8%。玉米粉糖化液對殘?zhí)蔷哂酗@著影響。綜上所述，確定多菌復(fù)合饅頭發(fā)酵劑混合培養(yǎng)工業(yè)培養(yǎng)基配方為A3B3C2D1，即玉米粉糖化液13%，豆粕水解液3%，硫酸銨1%，玉米漿0．8%。此配方與正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)第9組試驗(yàn)相同。經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，面包酵母生物量為5．8×108cfu／mL，漢遜酵母生物量為0．9×108cfu／mL，乳酸菌總生物量為3．4×108cfu／mL。

表2 多菌復(fù)合饅頭發(fā)酵劑工業(yè)培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results of optimization of industrial medium for multi－microbes complex steamed bread fermentation agent

3 討 論

混合培養(yǎng)一般是為了獲取更多的發(fā)酵產(chǎn)物，已有的報道大都以獲取某些純培養(yǎng)無法得到的產(chǎn)物和利用菌株之間協(xié)同作用，提高產(chǎn)率為目的［13－15］。以獲取菌體為目的的混合培養(yǎng)中試特別是不同菌屬之間的研究在國內(nèi)外尚未見到報道。本試驗(yàn)中優(yōu)化后的培養(yǎng)基，面包酵母菌生物量和混菌總生物量都是過去本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基的幾倍，與國內(nèi)一些研究相比各有優(yōu)劣。李翔國［16］用玉米面、葡萄糖、酵母粉和馬鈴薯淀粉做培養(yǎng)基對乳酸菌復(fù)合系培養(yǎng)生物量為5．0×107cfu／mL；楊麗麗［17］優(yōu)化了乳酸乳球菌乳脂亞種、嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌的增殖培養(yǎng)基，混菌生物量為2．1×109cfu／mL；劉丹［18］優(yōu)化了嗜酸乳桿菌的增菌培養(yǎng)基，優(yōu)化后生物量是8．6×109cfu／mL；A．Laitila［19］采用麥芽汁培養(yǎng)基培養(yǎng)植物乳桿菌，生物量是4．0×109cfu／mL。究其生物量產(chǎn)生差距的原因有：①所選用培養(yǎng)基原料上的差別所致，文獻(xiàn)中研究使用實(shí)驗(yàn)室分析純藥品，本試驗(yàn)中采用的是更加接近生產(chǎn)的玉米粉、豆粕等工業(yè)原料，營養(yǎng)素的濃度和純度上存在差距；②試驗(yàn)培養(yǎng)方法為順序接種，異常漢遜酵母、副干酪乳桿菌和嗜酸乳桿菌是在培養(yǎng)進(jìn)行9h之后同時接種，再培養(yǎng)11h后結(jié)束，這時兩株乳酸菌都還未進(jìn)入對數(shù)生長期，因此本試驗(yàn)混菌生物量與某些研究中的生物量會有一定差距。

4 結(jié) 論

多菌復(fù)合饅頭發(fā)酵劑混合培養(yǎng)工業(yè)培養(yǎng)基配方為：玉米粉糖化液13%、豆粕水解液3%、硫酸銨1．0%、玉米漿0．8%、KH2PO40．3%、MgSO4·7H2O 0．06%、MnSO40．02%，pH＝6．0。在優(yōu)化的培養(yǎng)基上進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，面包酵母生物量提高到5．8×108cfu／mL，與正交試驗(yàn)結(jié)果接近，是MRS培養(yǎng)基獲得面包酵母生物量 （1．4×108cfu／mL）的4倍以上；混菌總生物量可達(dá)到1．0×109cfu／mL。

［1］劉 慧，李平蘭，熊利霞，等．功能性開菲爾酸奶復(fù)合發(fā)酵劑的研制 ［J］．食品科學(xué)，2005，26 （12）：139－143．

［2］趙俊仁，孔保華．復(fù)合發(fā)酵劑生產(chǎn)風(fēng)干腸對產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)及游離氨基酸的影響 ［J］．食品工業(yè)科技，2007，28（10）：132－134．

［3］辛健康，薛泉宏．添加復(fù)合發(fā)酵劑對奶牛飼料純蛋白含量的影響 ［J］．飼料工業(yè)，2007，28（13）：50－52．

［4］蘇東民，胡麗花，蘇東海，等．饅頭發(fā)酵過程中酵母菌和乳酸菌的代謝作用 ［J］．食品科學(xué)，2010，31（13）：200－204．

［5］Clarke C，Schober TJ，Arendt EK．Effect of single strain and traditional mixed strain starter cultures in rheological properties of wheat dough and bread quality［J］．Cereal Chem，2002，79：640－647．

［6］趙玉紅，張立綱，龐偉娜．乳酸菌和酵母菌共生發(fā)酵生產(chǎn)面包的研究 ［J］．食品工業(yè)科技，2003，24（3）：61－62．

［7］馮 栩，李旭東，曾抗美，等．多株功能菌的混合培養(yǎng) ［J］．應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2009，15 （4）：523－528．

［8］張龍翔，張庭芳，李令媛．生化實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)［M］．北京：高等教育出版社，1997：342－343．

［9］李 冰．面制品復(fù)合發(fā)酵劑生產(chǎn)工藝及改善饅頭品質(zhì)的研究 ［D］．哈爾濱：黑龍江大學(xué)，2011．

［10］歐陽臻，李永輝，宿樹蘭，等．桑葉多糖的含量測定［J］．食品科學(xué)，2003，24 （11）：118－120．

［11］崔東良，佟建明，王云山，等．凝結(jié)芽孢桿菌工業(yè)化發(fā)酵培養(yǎng)基初步研究 ［J］．生產(chǎn)與科研經(jīng)驗(yàn)，2007，33 （12）：73－75．

［12］姜天笑，徐 曼，肖冬光，等．優(yōu)良面包酵母菌株的雜交育種 ［J］．微生物學(xué)通報，2008，35 （4）：550－554．

［13］向 東，王錫彬，符陽明．酵母發(fā)酵生產(chǎn)甘露醇的培養(yǎng)基優(yōu)化 ［J］．廣西輕工業(yè)，2011，（5）：15－17．

［14］張建雙，于 爽，郭曉兵，等．透性化酒精酵母細(xì)胞產(chǎn)海藻糖發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化 ［J］．大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，30 （5）329－332．

［15］T．M?retr?，I．M．Aasen，I．Storr?，et al．Production of sakacin P by Lactobacillus sakei in a completely defined medium ［J］．Journal of Applied Microbiology，2000，88（3）：536－545．

［16］李翔國，劉海峰，姜 飛，等．不同培養(yǎng)基對兩種乳酸菌復(fù)合系生長的影響 ［J］．延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報，2011，33 （3）：206－210．

［17］楊麗麗，韓 玲，張 麗．乳酸菌組合發(fā)酵菌種配方及其增殖培養(yǎng)基的優(yōu)化 ［J］．食品與發(fā)酵工程，2011，37 （11）：113－116．

［18］劉 丹，潘道東．直投式乳酸菌發(fā)酵劑增菌培養(yǎng)基的優(yōu)化 ［J］．食品科學(xué)，2005，26 （9）：204－207．

［19］A．Laitila，M．Saarela，L．Kirk．Malt sprout extract medium for cultivation of Lactobacillus plantarum protective cultures［J］．Letters in Applied Microbiology，2004，39：336－340．