藻紅蛋白調控ΔΨm誘導人乳腺癌MCF-7細胞凋亡

高世勇，王 靜，季宇彬

(1.哈爾濱商業(yè)大學生命科學與環(huán)境科學研究中心，哈爾濱150076;2.國家教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心，哈爾濱150076)

藻紅蛋白(Phycoerythrin，PE)是藻膽蛋白的一種，它廣泛存在于紅藻和龍須菜等植物中.根據(jù)來源藻紅蛋白可以被分為C-PE，B-PE，R-PE等，由脫輔基蛋白和開鏈四吡咯發(fā)色團經硫醚鍵共價結合形成并可以發(fā)出橙紅色的熒光.PE的光吸收峰位于490～570 nm之間，有的PE可產生兩個吸收峰，有的PE可產生3個吸收峰[1].藻紅蛋白有廣泛的藥理作用，其中抗腫瘤方面的作用尤為突出.藻紅蛋白可以作為熒光探針應用于熒光激活細胞分選、免疫組織化學、流式細胞測定、共聚焦激光顯微鏡、免疫細胞化學等熒光免疫的檢測[2].藻紅蛋白也可以作為光敏劑通過光動力學治療腫瘤.雖然藻紅蛋白介導的光敏反應能誘導人肝癌7721細胞和S180細胞的凋亡，但是其直接抗腫瘤作用及其機制的研究卻很少[3].本文以人乳腺癌MCF-7細胞為研究對象，觀察不同質量濃度的藻紅蛋白對MCF-7細胞的生長抑制及凋亡作用，并檢測了通過調節(jié)細胞內線粒體膜電位變化誘導MCF-7細胞凋亡的作用.探討藻紅蛋白對MCF-7細胞的凋亡作用機制.

1 實驗材料

1.1 細胞株和試劑

人乳腺癌MCF-7細胞株由哈爾濱商業(yè)大學藥物研究所博士后科研工作站傳代保種.藻紅蛋白由磐安縣鴻瑞生物科技有限公司提供.RPMI1640及胰酶為Gibco公司產品，胎牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司產品，溴化四氮唑藍(MTT)為Sigma公司產品，二甲基亞砜(DMSO)為上海前塵生物科技有限公司產品，Hoechst33258染色試劑盒為碧云天生物技術有限公司產品，TMRM為美國Molecular probe公司產品.

1.2 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱，美國NBS公司;酶標儀，美國Bio-Rad公司;熒光顯微鏡，德國Leica公司;激光共聚焦掃描顯微鏡，德國Leica公司.

2 實驗方法

2.1 腫瘤細胞培養(yǎng)

乳腺癌MCF-7細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100μg/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞生長狀態(tài)穩(wěn)定，呈對數(shù)生長期時，0.25%胰酶消化細胞，加入RPMI1640培養(yǎng)液將消化下來的細胞吹打均勻，調整細胞至適當質量濃度移入新的培養(yǎng)瓶中，添加培養(yǎng)液至適量，3～4 d傳代1次.

2.2 MTT法測定腫瘤細胞存活率

將處于對數(shù)生長期的MCF-7細胞用胰酶消化，細胞計數(shù)并調整細胞濃度為2×104個/mL的細胞懸液，按每孔100μL接種于96孔板當中，放置于37℃，含5%CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每孔加入100μL含不同質量濃度的PE每劑量設6個平行孔;陰性組加相同體積的培養(yǎng)液;陽性對照組藥為阿霉素，給藥后于37℃繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，棄去上清，每孔加入200μL新鮮配制含0.5 mg/mL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔加150 μL DMSO溶解，微型振蕩器振蕩混勻，酶標儀測定光密度值(OD)，參考波長490 nm，檢測波長570 nm.用下面公式計算藥物對腫瘤細胞的抑制率，并按中效方程計算IC50.

2.3 倒置顯微鏡觀察藻紅蛋白對細胞形態(tài)學的影響

取對數(shù)生長期的人乳腺癌MCF-7細胞，調整細胞濃度為105個/mL接種于培養(yǎng)瓶中，24 h后加入不同質量濃度的藻紅蛋白，置37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，置顯微鏡下觀察細胞形態(tài).

2.4 Hoechst33258染色熒光顯微鏡下觀察藻紅蛋白對MCF-7細胞形態(tài)學影響

取對數(shù)生長期的MCF-7細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細胞，輕輕吹打后制備獲得單細胞懸液，計數(shù)并調整細胞密度為1.5×105個/mL，接種于6孔板內，置于37℃，5%CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入不同質量濃度的藻紅蛋白，使其終質量濃度分別為40、80、160μg/mL;陽性對照組加入阿霉素，藥物質量終濃度為5μg/mL;陰性對照組加入相同體積的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，吸出舊培養(yǎng)液，加入1 mLPBS洗滌1次，吸出洗液，加入1mL胰蛋白酶進行消化，吸出消化液，加入2 mL新鮮的培基終止消化，將細胞完全吹下，吸至離心管中，2 000 r/min，10 min離心，棄上清，加入多聚甲醛固定30min，除去固定液，用PBS洗滌1次，吸盡液體，加入2 mL Hoechst33258染色液，37℃避光孵育30 min，移入六孔板內，熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，拍照.

2.5 流式細胞儀測定藻紅蛋白誘導MCF-7細胞凋亡的凋亡率

人乳腺癌MCF-7細胞以每瓶106個/mL接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h后，加入不同質量濃度的藻紅蛋白使其終質量濃度分別為40、80、160μg/L培養(yǎng)48 h，收集細胞，1 500 r/m離心5 min，PBS洗1次，70%冰乙醇-20℃固定過夜，PBS洗1次，加入PI染液(含PI 50mg/mL，RNase 1g/L，0.1%TritonX-100)，調整細胞為106個/mL，4℃避光染色30 min，300目尼龍網(wǎng)過濾后上機檢測，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm，檢測細胞數(shù)為104個.

2.6 激光共聚焦顯微鏡檢測MCF-7細胞中線粒體膜電位的變化

取對數(shù)生長期的人乳腺癌MCF-7細胞濃度為105個/mL細胞接種于6孔培養(yǎng)板，每孔1 mL，置培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h.24 h后加入不同質量濃度的藻紅蛋白，使其終質量濃度分別25、12.5、6.25 μg/L陽性對照組加阿霉素，其終質量濃度為1.5 μg/L;陰性對照組加相同體積的RPMI1640培養(yǎng)液;藥物作用48 h后，將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液吸出至離心管內，用PBS洗1遍，加入胰酶細胞消化液消化，細胞消化后，加入收集的細胞培養(yǎng)液，混勻，轉移至離心管內，1 500 r/min離心5 min，棄上清，收集細胞，加入適量的TMRE，37℃ 孵育60 min.孵育結束后，1 500 r/min離心5 min，棄上清，收集細胞，用PBS洗1遍，離心棄上清，用PBS重懸細胞后，激光共聚焦掃描顯微鏡觀察線粒體膜電位熒光強度(FI)，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為540～570 nm.物鏡APO CS40×/1.25oil，zoom＞1，pinhole 1.5 Airy，掃描方式(mode)為XYZ，format 512×512，結果見圖1.

圖1 作用48 h細胞凋亡形態(tài)

2.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析進行組間t檢驗，結果以表示.

3 實驗結果

3.1 MTT法檢測藻紅蛋白對MCF-7細胞的生長抑制率

MTT法檢測結果顯示，用不同質量濃度的藻紅蛋白培養(yǎng)細胞72 h后，可觀察到藻紅蛋白對MCF-7細胞的生長具有抑制作用，IC50為質量濃度81.60μg/mL.200μg/mL的藻紅蛋白在作用于MCF-7細胞72 h后，抑制率最高為89.41%，見表1.

3.2 倒置顯微鏡細胞形態(tài)學觀察

陰性組細胞貼壁完好，輪廓清晰，沒有破裂，起皺.給藻紅蛋白各組隨給藥質量濃度增加細胞生長密度逐漸變疏，表面起皺，高質量濃度組大部分細胞破碎，細胞形態(tài)不完整，貼壁減少，見圖1.

表1 藻紅蛋白對MCF－7抑制作用

3.3 熒光顯微鏡觀察藻紅蛋白對MCF-7細胞形態(tài)學影響

Hoechst33258熒光染色結果顯示，陰性對照組中MCF-7細胞染色質均勻，核形態(tài)規(guī)則，陽性對照組中細胞呈現(xiàn)致密濃染熒光.藻紅蛋白給藥組MCF-7細胞形態(tài)呈現(xiàn)出細胞凋亡現(xiàn)象，中劑量組可見細胞核固縮且碎裂，高劑量組可見細胞核呈現(xiàn)濃染，見圖2.

圖2 作用48 h細胞凋亡形態(tài)

3.4 流式細胞儀測定藻紅蛋白誘導MCF-7細胞凋亡率

從圖3及表2中可以得出，PE對MFC-7作用48 h后，凋亡率隨著劑量逐漸增大，40μg/mL時調亡率為25.18%.60μg/mL時凋亡率為55.45%，160μg/mL時凋亡率達到83.94%.

圖3 藻紅蛋白誘導MFC－7細胞凋亡率

表2 流式細胞儀檢測Phycoerythrin對MCF－7細胞的凋亡率

3.5 激光共聚焦顯微鏡檢測MCF-7細胞中線粒體膜電位的變化

從表3中可得出，不同質量濃度PE對MCF-7作用48 h后，線粒體膜電位熒光強度分別為24.40±0.21、20.45±0.24和19.77±0.27(空白組的膜電位為28.30±0.37);由此可知，PE可降低MCF-7細胞的線粒體膜電位，并且隨著PE劑量的增加，細胞內線粒體膜電位減幅也相應地增大，且與對照組相比都具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05).

表3 激光共聚焦顯微鏡檢測ΔΨm變化

4 討論

隨著對藻紅蛋白的深入研究，其藥理作用也越來越多的被發(fā)現(xiàn)，而藻紅蛋白在抗腫瘤方面的作用尤為突出.國內外大多數(shù)研究都是圍繞藻紅蛋白作為光敏劑或者熒光探針應用于腫瘤的治療中，而藻紅蛋白直接抗腫瘤的研究較少.近幾年來，才有關于藻紅蛋白粗提物直接抗腫瘤作用的報道.根據(jù)研究，藻紅蛋白粗提物能提高實驗小鼠機體抗突變、抗氧化和免疫能力.有研究表明，藻紅蛋白對人宮頸癌Hela細胞的生長有顯著的抑制作用并有明顯的劑量依賴關系.藻紅蛋白能將Hela細胞周期阻滯在G2/M期，抑制細胞增殖并誘導細胞調亡[4-5].

本實驗是研究不同劑量的藻紅蛋白對人乳腺癌MCF-7細胞的生長抑制及凋亡作用，并通過檢測藻紅蛋白對細胞內線粒體膜電位變化來研究藻紅蛋白是如何誘導人乳腺癌MCF-7細胞凋亡的.實驗中，MTT結果顯示藻紅蛋白對MCF-7細胞具有一定的細胞毒作用，且隨著龍藻紅蛋白質量濃度的增大而抑制作用增強，其對MCF-7細胞的IC50值為81.60μg/mL.通過倒置顯微鏡觀察在藻紅蛋白直接作用人乳腺癌MCF-7細胞48 h后，陰性對照組細胞排列相對緊密，無細胞變形破碎，隨給藥濃度增加細胞生長密度逐漸變疏，細胞皺縮，高濃度組大部分細胞破碎，細胞形態(tài)不完整，貼壁減少.說明藻紅蛋白對MCF-7細胞是有凋亡作用的，并呈劑量依賴關系.Hoechst33258染色以后，熒光顯微鏡下觀察，正常細胞的細胞核呈現(xiàn)均勻的藍色熒光，而凋亡細胞的細胞核則呈現(xiàn)出致密濃染或為碎塊狀濃染熒光.本實驗結果提示，藻紅蛋白作用于MCF-7細胞48 h后細胞形態(tài)發(fā)生變化，隨著劑量增加出現(xiàn)細胞凋亡現(xiàn)象，陰性對照組結果顯示MCF-7細胞染色質均勻，核形態(tài)規(guī)則，中劑量給藥組細胞核出現(xiàn)碎片，高劑量給藥組細胞核則呈致密濃染，這表明藻紅蛋白可導致MCF-7細胞形態(tài)學發(fā)生改變.本實驗利用碘化丙啶(PI)單染通過流式細胞儀檢測分析表明不同質量濃度的藻紅蛋白作用MCF-7細胞48 h后，有明顯凋亡峰出現(xiàn)，各組細胞凋亡率由低劑量組25.18%到中劑量55.45%到高劑量83.94%隨著藥物質量濃度增加而升高.進一步說明藻紅蛋白對MCF-7細胞的抑制作用與誘導腫瘤細胞凋亡有關.細胞凋亡的早期指標之一就是線粒體跨膜電位變化，而貫穿線粒體內膜和外膜的通道是PT孔[6-7].PT孔開放導致線粒體電子傳遞鏈與氧化磷酸化解偶聯(lián)、膜電位降低、ATP合成減少、還原性谷胱甘肽減少、細胞內活性氧增多，導致線粒體基質膨脹，外膜皺襞少，表面積小，易于破裂，釋放出膜間促凋亡蛋白，最終引起細胞凋亡[8-9].本實驗通過激光共聚焦顯微鏡檢測線粒體膜電位的變化，不同質量濃度PE對MCF-7作用48h后，線粒體膜電位熒光強度分別為24.40±0.21、20.45±0.24和19.77±0.27(空白組的膜電位為28.30±0.37);由此可知，PE可降低MCF-7細胞的線粒體膜電位，線粒體膜電位呈劑量性降低，因為線粒體膜電位是反映了線粒體功能的完整性，是評價線粒體功能的重要指標，隨著給藥質量濃度的增加，線粒體膜完整性被破壞，線粒體膜通透性轉運孔開放，引起線粒體膜電位的下降，最終細胞凋亡[10-11].

綜上所述，本研究提示藻紅蛋白對MCF-7細胞具有一定的細胞毒作用以及藻紅蛋白可降低MCF-7細胞內線粒體膜電位，初步斷定藻紅蛋白可以誘導MCF-7細胞凋亡，但是通過何種凋亡途徑還有待進一步的研究.

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