• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    中藥復方調(diào)控肝干細胞分化及機制的實驗研究

    2012-10-17 03:39:20陳利鋒趙映前劉建忠胡愛萍
    中國醫(yī)藥導報 2012年12期
    關(guān)鍵詞:牛黃肝細胞干細胞

    陳利鋒 趙映前 劉建忠 胡愛萍

    1.湖北中醫(yī)藥大學,湖北武漢 430065;2.湖北省中醫(yī)院,湖北武漢 430070

    肝干細胞是體內(nèi)存在的一種具有自我增殖能力和多向分化潛能的干細胞,可以分化為肝細胞和膽管上皮細胞等多種細胞。肝干細胞可參與肝臟的修復與重建,也是肝細胞移植、生物人工肝的重要細胞來源。近年來,人們發(fā)現(xiàn)肝干細胞移植對急慢性肝臟疾病有明確的治療作用,使得肝干細胞的研究成為熱點[1-2]。研究中選用西洋參、牛黃配伍,具有“益氣養(yǎng)陰、清熱解毒”之功,現(xiàn)代藥理研究證明牛黃、西洋參在改善肝功能、降低轉(zhuǎn)氨酶、抑制腫瘤細胞增殖等方面具有很好療效,但對肝干細胞的作用尚不十分清楚[3]。本實驗研究不同濃度牛黃參含藥血清對大鼠肝干細胞系WB-F344的增殖、誘導分化作用,觀察在誘導分化過程中細胞因子受體表達的變化,探討牛黃、西洋參復方對肝干細胞增殖、分化的影響,進一步揭示益氣解毒法對WB-F344細胞的作用機制。

    1 材料與試藥

    1.1 動物

    48只 SPF級雄性 Wistar大鼠,體重 180~200 g,由湖北省實驗動物研究中心提供,許可證號SCXK(鄂)2008-0005。鼠肝干細胞系WB-F344購自上海復祥生物科技有限公司。

    1.2 試藥

    體外培育牛黃、西洋參、牛黃參膠囊均由武漢健民大鵬藥業(yè)有限公司提供。DMEM高糖液體培養(yǎng)基(HYCLONE),10%滅活的特優(yōu)級胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司),無菌磷酸鹽(PBS)緩沖液(武漢博士德),青霉素、鏈霉素雙抗(西化儀北京科技有限公司)。胰蛋白酶、MTT、DMSO(美國GIBCO公司分裝)。地塞米松磷酸鈉注射液(湖北天藥藥業(yè)股份有限公司),胰島素(安徽宏業(yè)藥業(yè)有限公司),Trizol(總RNA抽提劑)、一抗稀釋液及二抗稀釋液(碧云天生物技術(shù)研究所生產(chǎn)),上、下游引物(BIONEER),F(xiàn)ermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國 MBI)。 HGF、EGF(美國派普泰克公司)。 兔抗鼠的 HGFR、EGFR 多克隆抗體、兔抗鼠的 TGFβR1、TGFβR2多克隆抗體(美國BIOWORLD公司),羊抗鼠的EGF多克隆抗體(美國SANTA CRUZ公司),辣根過氧化物酶HRP標記的兔抗羊抗體和山羊抗兔的二抗(美國BIOWORLD公司)??捡R斯亮藍G-250、考馬斯亮藍R-250、Tween-20(武漢華順生物科技有限公司),預(yù)染標準分子量蛋白Marker(FERMENTAS 公司)、麗春紅 S(SIGMA 分裝),TBS 緩沖液(10×)(BIOSHARP公司),ECL發(fā)光試劑盒(美國SANTA CRUZ公司),無水乙醇、甲醇、氯仿、異丙醇、苯酚(國藥集團化學試劑有限公司),牛血清白蛋白(武漢市貝爾生物技術(shù)有限公司)。GAPDH(上??党缮锕こ逃邢薰荆?。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 含藥血清的制備

    將大鼠分為空白組、水煎組、成分組,水煎組與成分組互為對照,每組各16只。體外培育牛黃、西洋參配伍組采用傳統(tǒng)水煎法灌胃動物制作含藥血清(水煎組);牛黃參膠囊是由西洋參和天然牛黃的替代品體外人工培育牛黃組方而成,取粉稀釋使用灌胃動物制作含藥血清(成分組)。各組給相應(yīng)的藥物連續(xù)灌胃7 d(1次/d),給藥濃度為:含牛黃生藥濃度3.6 g/L,含西洋參生藥濃度21.6 g/L,大鼠按體重100 g灌胃1 mL的量給藥,空白組灌胃等量的生理鹽水,連續(xù)1周,末次給藥后2 h進行大鼠頸動脈取血,將采集的血液在室溫中靜置 4 h,3 000 r/min,離心 15 min,將收集的血清在 56℃水浴30 min進行滅活,而后過濾除菌,分裝成小瓶于-20℃保存?zhèn)溆茫枰獣r用培養(yǎng)液配制成不同濃度的含藥血清。

    2.2 細胞的培養(yǎng)

    用50 mL的培養(yǎng)瓶,將WB-F344接種于含10%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素及鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中,細胞濃度為2×104個/mL,置于5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞換液時間為2~3 d,3~5 d傳代,0.25%胰蛋白酶消化后1∶2傳代。

    2.3 MTT法檢測細胞的增殖

    取對數(shù)生長期WB-F344細胞用胰酶消化,調(diào)密度為1×105/mL,按每孔100 μL接種96孔細胞培養(yǎng)板。于37℃、5%CO2條件下,用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后,分別加入濃度為5%、10%、20%的成分組與水煎組藥物血清,空白對照組加入5%、10%、20%的正常大鼠血清,正常對照組加入等量的培養(yǎng)液,以上每個濃度設(shè)6個平行孔,作用 24 h,每孔再加入 5 mg/mL MTT 25 μL,4 h 后棄上清液,加入DMSO 125 μL/孔,振蕩5 min左右,置于酶標儀上490 nm波長處測定吸光度OD值。

    2.4 Western blot檢測細胞因子及受體的表達

    以1×105/mL密度接種WB-F344細胞,待細胞長至80%時,無血清同步化24 h,加入10%成分組和水煎組的藥物血清干預(yù),24 h裂解收集細胞,再加入細胞裂解液冰面上裂解20 min,離心處理后收集上清即得總蛋白樣品。采用考馬斯亮藍法測蛋白濃度,去離子水稀釋蛋白濃度至2.5 μg/μL,按照每孔上樣總蛋白的量50 μg,每條泳道上樣20 μL。在進行SDS-PAGE電泳之前,需將配好的蛋白樣品置入95℃加熱5 min使蛋白變性。制備凝膠電泳,將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上,加入封閉液37℃封閉1 h。封閉完畢后,用TBST洗滌液洗滌膜條3次,每次10 min。1∶1 000稀釋一抗,低溫孵育過夜。一抗孵育完畢后,用TBST洗滌液洗滌膜條3次,每次10 min。1∶500稀釋二抗,37℃孵育2 h,應(yīng)用增強的化學發(fā)光法顯影,曝光洗片,Band scan分析膠片灰度值。

    2.5 RT-PCR檢測ALB mRNA的表達

    取密度為5×103/孔WB-F344細胞接種于細胞培養(yǎng)板,8 h后換分化培養(yǎng)體系(高糖DMEM、10%胎牛血清、HGF 50 ng/mL、EGF 20 ng/mL、胰島素 1 μg/mL、地塞米松 1 μmol/L),加入10%成分組和水煎組的含藥血清,并設(shè)正常對照孔和空白血清對照孔。1~5 d用 HGF 50 ng/mL,后改為 10 ng/mL維持,3 d換液 1 次,連續(xù)培養(yǎng),于 0、7、10、14、21 d 分別收集分化培養(yǎng)細胞,裂解液提取總RNA,測定RNA濃度,用RT試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后以cDNA的第1鏈為模板進行PCR擴增,引物由BIONEER公司合成。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性4 min,然后按 94℃變性30 s→55℃退火 30 s→72℃延伸30 s,循環(huán)35次后,72℃延伸10 min。應(yīng)用千屏多媒體凝膠成像系統(tǒng)對DNA電泳條帶進行分析,測定各條帶的面積和灰度值,得出積分灰度值,計算各個樣品與β-actin的比值作為ALB mRNA表達的相對定量,重復4次。

    2.6 統(tǒng)計學方法

    采用SPSS 13.0軟件進行分析,計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示,多組均數(shù)間比較行完全隨機設(shè)計的方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2.7 結(jié)果

    2.7.1 MTT檢測牛黃參含藥血清對WB-F344細胞增殖的影響 結(jié)果表明,10%、20%濃度的牛黃參含藥血清成分組和水煎組均能刺激WB-F344細胞的增殖,與空白、正常對照組比較OD值顯著升高(P<0.01),且10%為細胞增殖的最佳濃度梯度;各組含藥血清對WB-F344細胞作用24 h后,未表現(xiàn)出對細胞的毒性作用,鏡下觀察各組細胞生長良好。見表1。

    2.7.2 Western blot檢測牛黃參含藥血清對WB-F344細胞因子及受體表達的影響 結(jié)果表明,牛黃參含藥血清成分組和水煎組均可以刺激WB-F344細胞因子,HGFR、EGF、EGFR、TGF-β1R、TGF-β2R 的表達量升高,與正常組、空白組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。見表2。

    2.7.3 RT-PCR檢測牛黃參含藥血清對WB-F344細胞ALB mRNA表達的影響 表3結(jié)果表明,牛黃參含藥血清成分組和水煎組干預(yù)的WB-F344肝干細胞表面標志物ALB mRNA的表達在分化過程中隨著時間的延長逐漸增多;增漲幅度與正常組、空白組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01),且成分組優(yōu)于水煎組。見表3。

    表1 不同濃度牛黃參含藥血清對WB-F344增殖的影響(±s,n=6)

    表1 不同濃度牛黃參含藥血清對WB-F344增殖的影響(±s,n=6)

    注:與正常組比較,P<0.01;與空白組比較,P<0.01;與 5%比較,●P<0.01

    組別OD值正常組空白組5%10%20%成分組5%10%20%水煎組5%10%20%1.068 000±0.155 004 1.113 567±0.138 459 1.170 167±0.174 112 1.120 533±0.118 125 1.083 517±0.072 461 1.432 433±0.093 332★▲●1.409 067±0.184 952★▲●1.078 950±0.073 443 1.391 367±0.065 870★▲●1.321 733±0.051 570★▲●★▲

    3 討論

    一直以來,許多學者致力于尋找能夠刺激肝細胞再生的基本因子,迄今關(guān)注較多的是肝細胞生長因子(HGF)、干細胞生長因子(SCF)、表皮生長因子(EGF)、酸性成纖維細胞因子(FGF)、轉(zhuǎn)化因子 β1(TGF-β1)、轉(zhuǎn)化因子 β2(TGF-β2)、角質(zhì)細胞因子、干擾素、白細胞介素-1、白細胞介素-6和胰島素等等。已證實在肝臟受損后的肝細胞修復過程中,這些細胞因子通過促進肝干細胞的增殖、分化以及拮抗其凋亡起著重要的調(diào)控作用[4]。

    HGF是最早被認識在肝再生過程中起重要作用的細胞因子之一,通過與受體HGFR相互作用而對多種細胞產(chǎn)生促有絲分裂作用及促形態(tài)形成作用,在肝臟的發(fā)育成熟和再生過程中發(fā)揮重要作用,是干細胞向正常肝細胞分化有效的刺激因子之一。不過,其在細胞膜上受體數(shù)目相對固定,當HGF達到受體飽和的濃度后,單純HGF刺激將呈現(xiàn)出一定的飽和效應(yīng)。在發(fā)育的肝臟中,HGF誘導ALB陰性的干細胞分化為ALB陽性的干細胞,然后再在其他因素的作用下分化為成熟的肝細胞[5]。EGF是作用于肝干細胞增殖與分化的另一重要的細胞因子,通過與靶細胞膜上的受體EGFR結(jié)合刺激肝干細胞的增殖。EGF/EGFR在肝再生早期階段有促進有絲分裂的作用,并且鼠類比人類顯得尤為重要,是鼠類肝再生的必要條件。 TGFβ 家族(包括 TGF-β1,TGF-β2及 TGF-β3)可以抑制小鼠卵圓細胞系的有絲分裂,調(diào)節(jié)肝干細胞的增殖、分化,使其向成熟肝細胞和膽管細胞分化,而不向肝細胞癌或膽管細胞癌方向發(fā)展,其中TGF-β1在體細胞中所占比例最高、活性最強、分布最廣[6-9]。

    肝臟是合成ALB的唯一場所,幾乎所有的肝細胞體外誘導分化試驗都以ALB作為首選的檢測指標。因為ALB是檢測肝細胞代謝活性的一個標志物,也是反應(yīng)肝干細胞和成熟肝細胞活性和功能良好的指標之一[10-11]。本實驗結(jié)果顯示,經(jīng)中藥復方牛黃參含藥血清干預(yù)后,WB-F344細胞增殖明顯,10%為藥物血清增殖的最佳濃度梯度;HGFR、EGF、EGFR、TGF-β1R、TGF-β2R 表達量升高;ALB 表達顯著增多;而未經(jīng)藥物誘導的WB-F344對照組變化不顯著。提示牛黃、西洋參復方制劑能誘導肝干細胞系WB-F344向成熟肝細胞方向分化發(fā)育,且成分組牛黃參膠囊優(yōu)于水煎劑,這為應(yīng)用合適的中藥復方劑型治療重型肝炎、肝衰竭開辟了一條新途徑,也為中西醫(yī)結(jié)合治療肝病提供了一條新思路。這些只是研究的初步結(jié)果,在中藥復方牛黃參誘導WB-F344細胞分化過程中是否還存在其他因素參與調(diào)節(jié)以及調(diào)節(jié)過程中具體的信號通路如何,均有待于進一步研究。

    表2 牛黃參含藥血清對WB-F344細胞因子及受體表達的影響(±s,n=4)

    表2 牛黃參含藥血清對WB-F344細胞因子及受體表達的影響(±s,n=4)

    注:與正常組比較,★P<0.01;與空白組比較,▲P<0.01

    指標組別正常組 空白組 成分組 水煎組HGFR TGF-β1R TGF-β2R EGFR EGF 1.039 75±0.002 44 1.417 99±0.001 81 0.975 69±0.001 97 1.227 48±0.000 82 1.361 38±0.000 61 1.046 88±0.003 12 1.368 05±0.002 39 0.990 62±0.002 01 1.249 33±0.000 58 1.348 89±0.002 05 1.323 66±0.003 55★▲1.733 37±0.001 11★▲1.241 94±0.000 55★▲1.548 33±0.002 85★▲1.770 18±0.020 83★▲1.360 02±0.001 36★▲1.748 47±0.006 98★▲1.197 18±0.000 32★▲1.530 61±0.001 47★▲1.633 80±0.020 15★▲

    表3 牛黃參含藥血清對WB-F344細胞ALB mRNA表達的影響±s,n=4)

    表3 牛黃參含藥血清對WB-F344細胞ALB mRNA表達的影響±s,n=4)

    注:與正常組比較,★P<0.01;與空白組比較,▲P<0.01

    時間(d) 正常組 空白組水煎組071 0 14 21 0.979 28±0.005 77 1.001 35±0.001 96 1.015 06±0.000 39 1.032 19±0.002 07 1.055 37±0.004 52 0.979 35±0.006 92 1.002 70±0.004 50 1.014 89±0.000 34 1.031 20±0.000 22 1.054 97±0.002 27 0.977 80 1.025 08±0.017 84 1.051 86±0.002 72 1.132 82±0.002 29★1.179 03±0.003 01★0.976 16±0.005 97 1.004 71±0.003 30 1.035 07±0.005 11 1.118 96±0.001 48★1.142 45±0.002 61★

    [1]Chamuleau RA,Deurholt T,Hoekstra R.Which are the right cells to be used in a bioartificial liver? [J].Metab Brain Dis,2005,20(4):327-350.

    [2]Zdziarski P.Cellular transplantation-orthotopic liver transplantation al-ternative[J].Pol Merkur Lekarski,2007,23(136):297-301.

    [3]李玲青,趙映前.牛黃參含藥血清對人肝癌細胞HepG2的作用機理研究[D].武漢:湖北中醫(yī)藥大學:2010.

    [4]姚鵬,詹秩群,許望翔,等.細胞生長因子體外對大鼠肝干細胞的影響[J].中華肝臟病雜志,2003,11(1):33-36.

    [5]Suzuki A,Iwama A,Miyashita H,et al.Role for growth factors and extracelluar matrix in controlling differentiation of prospectively isolated hepatic stem cells[J].Development,2003,130:2513-2524.

    [6]林澤偉,陳斌,倪勇,等.大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分化為肝樣細胞的實驗研究[J].中國熱帶醫(yī)學,2006,6(4):574-576.

    [7]高植泉,陶開山,李韌,等.體外不同誘導條件下對大鼠胚胎肝干細胞分化影響的實驗研究[J].胃腸病學和肝病學雜志,2010,19(6):513-515.

    [8]Lee BS,Park M,Cha HY,et al.Hepatocyte growth factor induces delayed STAT3 phosphorylation through interleukin-6 expression[J].Cell Signal,2009,21(3):419-427.

    [9]鄺郁郁.不同濃度肝細胞生長因子和成纖維細胞生長因子對大鼠肝干細胞的增殖調(diào)控[J].國際病理科學與臨床雜志,2010,30(2):106-109.

    [10]楊志云,姚樹坤,殷飛,等.苦參堿含藥血清對大鼠肝干細胞的影響[J].中華實驗和臨床感染病雜志,2008,2(2):33-36.

    [11]曲鑫建,李惠俠,孫世鐸,等.模擬微重力條件下對WB-F344肝干細胞表征分子表達的影響[J].中國生物工程雜志,2007,27(10):17-21.

    猜你喜歡
    牛黃肝細胞干細胞
    干細胞:“小細胞”造就“大健康”
    外泌體miRNA在肝細胞癌中的研究進展
    牛黃應(yīng)用有門道
    造血干細胞移植與捐獻
    培育牛黃替代人工牛黃之牛黃降壓膠囊對SHR大鼠的降壓作用
    中成藥(2018年10期)2018-10-26 03:41:24
    干細胞產(chǎn)業(yè)的春天來了?
    只是喝酒
    金山(2016年6期)2016-07-14 21:50:13
    HPLC法同時測定牛黃抱龍片中7種成分
    中成藥(2016年8期)2016-05-17 06:08:21
    肝細胞程序性壞死的研究進展
    肝細胞癌診斷中CT灌注成像的應(yīng)用探析
    最近2019中文字幕mv第一页| 国产真实乱freesex| 免费看av在线观看网站| 3wmmmm亚洲av在线观看| 直男gayav资源| 一个人免费在线观看电影| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 日韩精品青青久久久久久| 亚洲性久久影院| 精品无人区乱码1区二区| 欧美成人a在线观看| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 在线观看美女被高潮喷水网站| 99热只有精品国产| www日本黄色视频网| 欧美不卡视频在线免费观看| 欧美最黄视频在线播放免费| 天堂网av新在线| 高清在线视频一区二区三区 | 亚洲内射少妇av| 波多野结衣高清无吗| 久久精品91蜜桃| 免费av不卡在线播放| 婷婷亚洲欧美| 亚洲性久久影院| 亚洲人成网站在线观看播放| 九九爱精品视频在线观看| 午夜福利成人在线免费观看| 欧美3d第一页| 99热6这里只有精品| av女优亚洲男人天堂| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产人妻一区二区三区在| 毛片一级片免费看久久久久| 91在线精品国自产拍蜜月| 中文字幕熟女人妻在线| av免费在线看不卡| 精品一区二区免费观看| 久久这里只有精品中国| 插逼视频在线观看| 免费看光身美女| 久久久欧美国产精品| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国产日韩欧美在线精品| 老女人水多毛片| 欧美高清性xxxxhd video| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 亚洲久久久久久中文字幕| 女人被狂操c到高潮| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 能在线免费观看的黄片| 中国美女看黄片| 亚洲精品国产av成人精品| 中国美女看黄片| 欧美激情在线99| 国产精品爽爽va在线观看网站| av国产免费在线观看| 2022亚洲国产成人精品| 此物有八面人人有两片| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 中国美女看黄片| 最近手机中文字幕大全| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 亚洲av一区综合| 听说在线观看完整版免费高清| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 色哟哟·www| 九九热线精品视视频播放| 日本黄色视频三级网站网址| 夫妻性生交免费视频一级片| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 在线a可以看的网站| 在线天堂最新版资源| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 黄色配什么色好看| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产一级毛片七仙女欲春2| 日韩欧美 国产精品| 久久99精品国语久久久| 91aial.com中文字幕在线观看| 黄片无遮挡物在线观看| 国产极品天堂在线| 人人妻人人澡欧美一区二区| 日本免费一区二区三区高清不卡| 日韩精品青青久久久久久| av免费观看日本| 久久精品国产自在天天线| 最新中文字幕久久久久| 成人国产麻豆网| 国产精品人妻久久久影院| 黑人高潮一二区| 91久久精品国产一区二区三区| 乱人视频在线观看| 亚洲五月天丁香| 一区二区三区四区激情视频 | 成人午夜精彩视频在线观看| kizo精华| 天天一区二区日本电影三级| 欧美不卡视频在线免费观看| 黄色日韩在线| 亚洲第一区二区三区不卡| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 2021天堂中文幕一二区在线观| 黄片无遮挡物在线观看| 国内揄拍国产精品人妻在线| 日韩三级伦理在线观看| a级毛片a级免费在线| 国产高清有码在线观看视频| 最后的刺客免费高清国语| 国产麻豆成人av免费视频| 国产麻豆成人av免费视频| 久久草成人影院| 亚洲av成人精品一区久久| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 成人午夜精彩视频在线观看| 欧美不卡视频在线免费观看| 国产精品乱码一区二三区的特点| 久久久久久久久中文| 看黄色毛片网站| 尾随美女入室| 在线观看66精品国产| 国产免费一级a男人的天堂| 日韩精品青青久久久久久| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲av中文av极速乱| 国产真实伦视频高清在线观看| 日本与韩国留学比较| 只有这里有精品99| 午夜福利在线在线| 五月伊人婷婷丁香| 亚洲综合色惰| 舔av片在线| 日韩av在线大香蕉| 中国美女看黄片| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产麻豆成人av免费视频| 精品无人区乱码1区二区| 男人的好看免费观看在线视频| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产高清有码在线观看视频| 亚洲av熟女| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 午夜激情欧美在线| 亚洲av电影不卡..在线观看| 亚洲欧美精品综合久久99| 99久国产av精品| 国产av一区在线观看免费| av在线老鸭窝| 看片在线看免费视频| 亚洲图色成人| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 午夜精品一区二区三区免费看| 亚洲欧美成人精品一区二区| 亚洲在久久综合| 在线a可以看的网站| 国产精品综合久久久久久久免费| av天堂中文字幕网| 波多野结衣巨乳人妻| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 国产成人a区在线观看| 成人欧美大片| 在线播放无遮挡| 大香蕉久久网| kizo精华| 蜜臀久久99精品久久宅男| 最近中文字幕高清免费大全6| 九九在线视频观看精品| 久久中文看片网| 精华霜和精华液先用哪个| 国产三级中文精品| 国产一区二区在线观看日韩| 国产精品无大码| 免费无遮挡裸体视频| 国产精品.久久久| 夫妻性生交免费视频一级片| 日韩人妻高清精品专区| 国产极品精品免费视频能看的| 日本五十路高清| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 亚州av有码| or卡值多少钱| 一边摸一边抽搐一进一小说| 人妻少妇偷人精品九色| 极品教师在线视频| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 能在线免费看毛片的网站| 欧美色视频一区免费| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 国产69精品久久久久777片| 欧美成人精品欧美一级黄| 成人亚洲精品av一区二区| 成年免费大片在线观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲成a人片在线一区二区| 精品人妻熟女av久视频| 亚洲精品456在线播放app| 亚洲国产精品久久男人天堂| 看黄色毛片网站| 久久久久久久久久久免费av| 日本成人三级电影网站| 精品熟女少妇av免费看| 边亲边吃奶的免费视频| 少妇人妻一区二区三区视频| 99久久中文字幕三级久久日本| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 一区二区三区四区激情视频 | 日韩国内少妇激情av| 国产精品久久久久久久电影| 一进一出抽搐gif免费好疼| 少妇人妻一区二区三区视频| 亚州av有码| 99在线人妻在线中文字幕| 青青草视频在线视频观看| 插阴视频在线观看视频| 99久国产av精品| 成人综合一区亚洲| 伦精品一区二区三区| 悠悠久久av| 少妇丰满av| 久久久久久久久久黄片| 黄色视频,在线免费观看| 国产成人a∨麻豆精品| 1024手机看黄色片| 国产69精品久久久久777片| 一本精品99久久精品77| 亚洲无线观看免费| 人体艺术视频欧美日本| 久久欧美精品欧美久久欧美| 免费av毛片视频| 免费看美女性在线毛片视频| 亚洲精品国产av成人精品| a级毛色黄片| 日韩欧美在线乱码| 看免费成人av毛片| 国产爱豆传媒在线观看| 亚州av有码| av在线播放精品| 欧美色视频一区免费| 特大巨黑吊av在线直播| 午夜精品一区二区三区免费看| 亚洲最大成人中文| av天堂中文字幕网| 免费看a级黄色片| 男女边吃奶边做爰视频| а√天堂www在线а√下载| av女优亚洲男人天堂| 亚洲久久久久久中文字幕| 日韩欧美在线乱码| 久久久色成人| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 亚洲国产色片| 久久精品夜色国产| 久久99热6这里只有精品| av在线老鸭窝| 国产精品人妻久久久久久| ponron亚洲| 国产男人的电影天堂91| 一夜夜www| 一夜夜www| 久久九九热精品免费| 国产精品蜜桃在线观看 | 免费av观看视频| 永久网站在线| 国产 一区精品| 国产精品av视频在线免费观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产精品久久久久久久电影| 只有这里有精品99| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 91在线精品国自产拍蜜月| videossex国产| 免费看av在线观看网站| 18+在线观看网站| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 九色成人免费人妻av| 久久九九热精品免费| 久久人妻av系列| 国产精品1区2区在线观看.| 美女大奶头视频| 黄色视频,在线免费观看| 午夜激情福利司机影院| 可以在线观看毛片的网站| 国产午夜福利久久久久久| 亚洲美女视频黄频| 18禁在线播放成人免费| 最近的中文字幕免费完整| 国产在线精品亚洲第一网站| 成人特级黄色片久久久久久久| 久久亚洲精品不卡| 青青草视频在线视频观看| 在线免费十八禁| 十八禁国产超污无遮挡网站| 全区人妻精品视频| 美女国产视频在线观看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产精品永久免费网站| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产一区亚洲一区在线观看| 中国国产av一级| 午夜福利视频1000在线观看| 午夜精品国产一区二区电影 | 一区二区三区免费毛片| 精品一区二区三区视频在线| 亚洲国产精品久久男人天堂| 黄色欧美视频在线观看| 亚洲国产高清在线一区二区三| 国产精品免费一区二区三区在线| 国产高清有码在线观看视频| 少妇人妻精品综合一区二区 | 女同久久另类99精品国产91| 我的女老师完整版在线观看| 嫩草影院入口| 亚洲av不卡在线观看| 国产探花极品一区二区| 国产成人精品久久久久久| 99热网站在线观看| 亚洲精品国产成人久久av| 三级毛片av免费| 日韩一区二区视频免费看| 国产精品一区二区性色av| 亚洲国产欧美人成| 国产成人aa在线观看| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产精品99久久久久久久久| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| www.色视频.com| 欧美zozozo另类| 中出人妻视频一区二区| 少妇的逼水好多| 一区二区三区高清视频在线| 少妇的逼好多水| 国产麻豆成人av免费视频| a级一级毛片免费在线观看| 在线观看av片永久免费下载| av在线天堂中文字幕| 最近2019中文字幕mv第一页| 中文字幕av在线有码专区| 此物有八面人人有两片| 亚洲最大成人av| 久久人人爽人人片av| 国产在线男女| 2021天堂中文幕一二区在线观| 丝袜美腿在线中文| 又爽又黄a免费视频| 欧美最新免费一区二区三区| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲精品久久国产高清桃花| 色尼玛亚洲综合影院| 天堂中文最新版在线下载 | 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 91久久精品国产一区二区成人| 直男gayav资源| 国产高潮美女av| 观看美女的网站| 亚洲国产精品久久男人天堂| h日本视频在线播放| 草草在线视频免费看| 男插女下体视频免费在线播放| 久久久久久久久中文| 午夜a级毛片| 亚洲成人久久爱视频| 岛国毛片在线播放| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 少妇的逼好多水| 久久久久网色| 少妇熟女aⅴ在线视频| 爱豆传媒免费全集在线观看| 久久人人爽人人片av| 久久鲁丝午夜福利片| 亚洲自偷自拍三级| 三级毛片av免费| 国产精品国产高清国产av| 亚洲av免费在线观看| 欧美xxxx性猛交bbbb| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲va在线va天堂va国产| 欧美高清成人免费视频www| 日本色播在线视频| 最近手机中文字幕大全| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 日韩 亚洲 欧美在线| www.av在线官网国产| 黑人高潮一二区| 成人永久免费在线观看视频| 人人妻人人澡欧美一区二区| 狠狠狠狠99中文字幕| 一级毛片aaaaaa免费看小| 日本色播在线视频| 亚洲四区av| 日韩成人伦理影院| 99热网站在线观看| 国产中年淑女户外野战色| 亚洲经典国产精华液单| 床上黄色一级片| 亚洲av电影不卡..在线观看| 日本黄色视频三级网站网址| 日韩强制内射视频| 亚洲国产精品久久男人天堂| 日韩人妻高清精品专区| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 国产 一区 欧美 日韩| 欧美日本亚洲视频在线播放| 97热精品久久久久久| 99精品在免费线老司机午夜| 少妇被粗大猛烈的视频| 日本欧美国产在线视频| 91狼人影院| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 国产成人aa在线观看| 色综合色国产| 一边亲一边摸免费视频| 美女高潮的动态| 亚洲成人av在线免费| 久久久久久伊人网av| 亚洲成人久久爱视频| 少妇高潮的动态图| 亚洲自偷自拍三级| 国产一级毛片在线| 夫妻性生交免费视频一级片| 一边亲一边摸免费视频| 成人亚洲精品av一区二区| 国产一级毛片七仙女欲春2| 69av精品久久久久久| 看片在线看免费视频| 国产精品福利在线免费观看| 能在线免费看毛片的网站| 少妇的逼水好多| 日本色播在线视频| 精品欧美国产一区二区三| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 国产高清激情床上av| 乱系列少妇在线播放| 91精品一卡2卡3卡4卡| www.色视频.com| 性色av一级| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 日本黄色日本黄色录像| 亚洲精品乱久久久久久| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 99九九线精品视频在线观看视频| 久久久久久人妻| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 久久综合国产亚洲精品| 国产免费又黄又爽又色| 久久精品国产自在天天线| 老司机亚洲免费影院| 国产毛片在线视频| 十分钟在线观看高清视频www| 韩国av在线不卡| 日本免费在线观看一区| 亚洲精品国产av蜜桃| 日本欧美视频一区| av免费观看日本| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 免费观看在线日韩| 人人澡人人妻人| 免费少妇av软件| 视频区图区小说| 久久精品久久久久久久性| 满18在线观看网站| 男男h啪啪无遮挡| 欧美+日韩+精品| 精品国产乱码久久久久久小说| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产精品久久久久久久电影| av天堂久久9| 男人添女人高潮全过程视频| www.色视频.com| 成人二区视频| 日韩av不卡免费在线播放| 国模一区二区三区四区视频| 高清视频免费观看一区二区| 精品久久国产蜜桃| 久久久久久久久久久丰满| 亚洲精品视频女| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| .国产精品久久| 丰满迷人的少妇在线观看| 日本欧美视频一区| 搡女人真爽免费视频火全软件| 久久久精品区二区三区| 制服丝袜香蕉在线| 精品国产国语对白av| 人妻一区二区av| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 51国产日韩欧美| 寂寞人妻少妇视频99o| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 免费人成在线观看视频色| 亚洲国产精品专区欧美| 国产一级毛片在线| 蜜臀久久99精品久久宅男| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲欧美精品自产自拍| 免费观看无遮挡的男女| 国产av一区二区精品久久| 亚州av有码| 涩涩av久久男人的天堂| 一区二区av电影网| 欧美日韩亚洲高清精品| 在线看a的网站| 美女内射精品一级片tv| 黄色一级大片看看| 男女高潮啪啪啪动态图| 精品视频人人做人人爽| 色吧在线观看| 国产日韩欧美亚洲二区| 日本午夜av视频| 久久99热6这里只有精品| 免费观看av网站的网址| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 不卡视频在线观看欧美| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 在线观看免费视频网站a站| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| videos熟女内射| 精品少妇黑人巨大在线播放| 亚洲伊人久久精品综合| 三上悠亚av全集在线观看| av播播在线观看一区| 欧美丝袜亚洲另类| 最新的欧美精品一区二区| 久久国内精品自在自线图片| 欧美最新免费一区二区三区| 精品少妇内射三级| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产成人免费无遮挡视频| 免费看光身美女| 国产黄片视频在线免费观看| 亚洲国产精品999| 一级毛片电影观看| 国产av一区二区精品久久| 日韩av免费高清视频| 亚洲欧美色中文字幕在线| 日韩制服骚丝袜av| 丰满饥渴人妻一区二区三| 久久免费观看电影| 女性被躁到高潮视频| 久久99一区二区三区| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 日本黄色日本黄色录像| 国产高清国产精品国产三级| 另类亚洲欧美激情| 伦理电影免费视频| 亚洲精品久久成人aⅴ小说 | 国产亚洲精品久久久com| 九九在线视频观看精品| 男男h啪啪无遮挡| 欧美最新免费一区二区三区| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 伦理电影大哥的女人| 日本av手机在线免费观看| 18+在线观看网站| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 亚洲av国产av综合av卡| 曰老女人黄片| 熟女电影av网| 我要看黄色一级片免费的| 九九在线视频观看精品| videossex国产| 全区人妻精品视频| 亚洲精品av麻豆狂野| 看十八女毛片水多多多| 最近中文字幕高清免费大全6| 欧美激情国产日韩精品一区| 欧美另类一区| 免费人成在线观看视频色| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 天天影视国产精品| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 亚洲伊人久久精品综合| 精品亚洲成国产av| 日韩大片免费观看网站| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产成人91sexporn| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 视频区图区小说| 亚洲精品一区蜜桃| 精品国产一区二区久久| 免费黄网站久久成人精品| 亚洲国产精品专区欧美| 免费黄频网站在线观看国产| 精品久久蜜臀av无| 精品人妻在线不人妻| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 亚洲,欧美,日韩| 日韩成人av中文字幕在线观看| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产探花极品一区二区| 一区二区三区四区激情视频| 久久国产精品大桥未久av| 久久国内精品自在自线图片| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产黄色视频一区二区在线观看| 天天操日日干夜夜撸| 丝袜脚勾引网站| 中文天堂在线官网| 51国产日韩欧美| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 国内精品宾馆在线| 亚洲无线观看免费| 亚洲国产av影院在线观看| 免费日韩欧美在线观看| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 老司机影院成人| 91午夜精品亚洲一区二区三区|