唑來(lái)膦酸注射劑細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的研究

高 峰 石 峰 魏國(guó)義

1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院，北京 100029；2.保諾科技（北京）有限公司，北京 102206

唑來(lái)膦酸是美國(guó)FDA批準(zhǔn)的第3代雙膦酸鹽類藥物，在臨床上用于惡性腫瘤溶骨性骨轉(zhuǎn)移引起的骨痛、惡性腫瘤引起的高鈣血癥以及老年原發(fā)性骨質(zhì)疏松等骨吸收增加類疾病。目前國(guó)產(chǎn)的唑來(lái)膦酸注射劑主要有注射用粉針和注射液，且有多個(gè)廠家生產(chǎn)，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)口藥品注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)等多個(gè)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)共存，其熱原檢查方法有家兔法和細(xì)菌內(nèi)毒素法，不同標(biāo)準(zhǔn)的檢查限度存在差異。為統(tǒng)一該品種的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查標(biāo)準(zhǔn)，筆者按照《中國(guó)藥典》2010年版附錄中細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法[1-2]，對(duì)唑來(lái)膦酸注射劑進(jìn)行提高限度菌內(nèi)毒素檢查，以統(tǒng)一其標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果報(bào)道如下：

1 儀器與試藥

TW12六孔恒溫水浴 （產(chǎn)自Julabo公司）；MSI旋渦混合器（購(gòu)自廣州IKA公司）。

細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品 （規(guī)格：每支120 EU，批號(hào)：150601-200699）購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（規(guī)格：50 mL/支，批號(hào)：1105060）及鱟試劑（TAL）A（規(guī)格：0.1 mL/支，批號(hào)：1101202，靈敏度：0.25 EU/mL）購(gòu)自湛江安度斯生物有限公司；TAL B（規(guī)格：0.1 mL/支，批號(hào)：110603，靈敏度：0.25 EU/mL）購(gòu)自廈門(mén)市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司；注射用唑來(lái)膦酸分別產(chǎn)自深圳海王有限公司，批號(hào)：20100502，吉林西點(diǎn)藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20100121，南京制藥廠有限公司，批號(hào)：20101101；唑來(lái)膦酸注射液分別產(chǎn)自江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：1005281，成都天臺(tái)山制藥有限公司，批號(hào)100601。

2 方法與結(jié)果

2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素限值的確定

根據(jù)限度最高的標(biāo)準(zhǔn)，注射用唑來(lái)膦酸細(xì)菌內(nèi)毒素限值定為5.0 EU/g；唑來(lái)膦酸注射液細(xì)菌內(nèi)毒素限值定為3.5 EU/mL。

2.2 鱟試劑靈敏度的復(fù)核

鱟試劑標(biāo)示靈敏度（λ）的復(fù)核按照《中國(guó)藥典》2010年版二部附錄細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的要求進(jìn)行試驗(yàn)。檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)結(jié)果

由表1可見(jiàn)，三批鱟試劑λC均在0.5λ～2.0λ之間，符合細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的規(guī)定。

2.3 干擾預(yù)試驗(yàn)[3-7]

2.3.1 根據(jù)公式，最小有效稀釋濃度C=λ/L，L值一般取5.0 EU/mg，目前市售鱟試劑靈敏度（λ）在 0.25～0.03 EU/mL之間，故注射用唑來(lái)膦酸進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)時(shí)的不同靈敏度鱟試劑所對(duì)應(yīng)的最大有效稀釋濃度分別為0.050 00、0.025 00、0.012 50、0.006 25 mg/mL。唑來(lái)膦酸注射液的限度L=3.5 EU/mL，故唑來(lái)膦酸注射液進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的鱟試劑所對(duì)應(yīng)的最小有效稀釋倍數(shù)分別為 14、28、56、112。

2.3.2 預(yù)試驗(yàn)操作為取三批注射用唑來(lái)膦酸，用BET檢查用水將樣品稀釋成 0.050 00、0.025 00、0.012 50、0.006 25 mg/mL共4個(gè)濃度梯度的溶液，將此系列濃度溶液標(biāo)記為供試品管（NPC系列）。取兩批唑來(lái)膦酸注射液，用BET檢查用水分別將樣品稀釋14、28、56、112倍，以上述稀釋液作為溶劑，溶解并稀釋細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，制得每個(gè)稀釋度中細(xì)菌內(nèi)毒素含量均為2λ（0.5 EU/mL）的唑來(lái)膦酸溶液，標(biāo)記此系列溶液為供試品陽(yáng)性對(duì)照管（PPC系列）。取靈敏度為0.25 EU/mL的兩個(gè)不同廠家的鱟試劑進(jìn)行試驗(yàn)，每一稀釋度做兩管，同時(shí)按常規(guī)分別設(shè)細(xì)菌內(nèi)毒素陽(yáng)性對(duì)照（PC）和檢查用水陰性對(duì)照（NC）各兩管，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

從表2可見(jiàn)，所用的三批注射用唑來(lái)膦酸的最大無(wú)干擾濃度不低于0.050 00 mg/mL，兩批唑來(lái)膦酸注射液最小無(wú)干擾稀釋倍數(shù)不高于14倍，在此條件下，受試樣品對(duì)兩個(gè)廠家的鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素反應(yīng)均無(wú)干擾作用。

2.4 正式干擾試驗(yàn)

用兩個(gè)廠家的鱟試劑（靈敏度為0.25 EU/mL），按《中國(guó)藥典》2010年版方法進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)定用BET水制成的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（Es）和用供試品稀釋液制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（Et）。取三批注射用唑來(lái)膦酸，分別加BET檢查用水稀釋成0.05mg/mL，兩批唑來(lái)膦酸注射液分別加BET檢查用水稀釋14倍，再用BET水和供試品稀釋液將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成 2.00λ、1.00λ、0.50λ、0.25λ 濃度的 BET 水系列細(xì)菌內(nèi)毒素溶液和供試品稀釋液系列細(xì)菌內(nèi)毒素溶液，每一稀釋濃度重復(fù)4管，同時(shí)用上述供試品稀釋液和BET水各做兩管陰性對(duì)照管，按下列公式計(jì)算BET水和供試品稀釋液反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（Es 和 Et），Es=lg-1（∑Xs/4），Et=lg-1（∑Xt/4）。 見(jiàn)表 3。

表3 樣品干擾試驗(yàn)結(jié)果

從表 3 結(jié)果可見(jiàn)，2.00λ 管均為陽(yáng)性，0.50λ、0.25λ 管均為陰性，對(duì)于λ=0.25 EU/mL的兩組鱟試劑的Es為0.25 EU/mL，Es均在0.50λ～2.00λ范圍內(nèi)，各批唑來(lái)膦酸制劑測(cè)得的Et均在 0.50λ～2.00λ 范圍內(nèi)，Et和 Es的比值在 0.5～2.0 之間，說(shuō)明唑來(lái)膦酸制劑在該實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)兩個(gè)不同廠家的鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)無(wú)干擾作用。

2.5 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

取三批注射用唑來(lái)膦酸和兩批唑來(lái)膦酸注射液，分別根據(jù)"2.4"項(xiàng)下方法制成供試品稀釋液，使用兩個(gè)廠家的鱟試劑按現(xiàn)行《中國(guó)藥典》2010年版細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，結(jié)果見(jiàn)表4、5。各批唑來(lái)膦酸注射劑的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查均符合規(guī)定。

3 討論

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法是目前應(yīng)用最為廣泛的熱原檢查法的體外替代檢測(cè)方法，但該方法存在易受到各種檢測(cè)因素干擾的缺點(diǎn)，故統(tǒng)一其市面上流通的同一品種的限度標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)提高其用藥標(biāo)準(zhǔn)，改善其制劑工藝有著重要意義。本研究采用兩個(gè)不同廠家不同靈敏度的鱟試劑對(duì)各個(gè)不同廠家生產(chǎn)的唑來(lái)膦酸注射劑進(jìn)行試驗(yàn)，認(rèn)為同樣的細(xì)菌內(nèi)毒素限度標(biāo)準(zhǔn)對(duì)它們進(jìn)行質(zhì)量控制是可行的，對(duì)于提高其注射用制劑的水平奠定了基礎(chǔ)[7-8]。

表4 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果1

表5 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果2

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