GeneFinderTM 核酸染料對(duì)玉米花粉管通道導(dǎo)入路徑的研究

劉芳，黃立楠

（大慶油田農(nóng)場(chǎng)，大慶163458）

花粉管通道法（pollen tube pathway）是由我國(guó)科學(xué)家周光宇首先提出和設(shè)計(jì)的[1-4]。20世紀(jì)70年代以來，花粉管通道法在改良玉米、水稻、小麥、大豆和棉花等多種作物的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)及抗性等方面得到了廣泛的應(yīng)用，大量試驗(yàn)結(jié)果表明，外源DNA 通過該途徑導(dǎo)入受體后，不僅出現(xiàn)廣泛變異，并在一些作物中已選育到優(yōu)良的穩(wěn)定遺傳新品系[5]。然而花粉管通道法轉(zhuǎn)化技術(shù)的關(guān)鍵在于花粉管通道的導(dǎo)入路徑，本文將選用一種新的試驗(yàn)方法，即通過GeneFinderTM核酸染料對(duì)外源DNA 導(dǎo)入路徑進(jìn)行觀察和分析。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供體：高粱（吉甜粱2 號(hào)系）；受體：玉米（Zea mays L.）優(yōu)良自交系4112。供試材料高粱和玉米分別由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種研究所和玉米所提供。

熒光染料為核酸染料GeneFinderTM（百維信生物科技有限公司，廈門，中國(guó)），該染料屬于花青類染料，毒性很低，使用安全，可有效保護(hù)實(shí)驗(yàn)操作者和環(huán)境。GeneFinderTM與dsDNA 結(jié)合熒光信號(hào)可增強(qiáng)800～1 000 倍，其檢測(cè)核酸的靈敏度比EB 染色法平均高10 倍左右，具有安全、靈敏、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，在紫外透射光下雙鏈DNA 與該染料結(jié)合呈現(xiàn)綠色熒光。

1.2 花粉管通道導(dǎo)入外源總DNA 技術(shù)

采用CTAB 法提取供體材料的總DNA[6]，供體高粱用于外源DNA 導(dǎo)入工作的溶液濃度為10 ng ·mL-1。

隨機(jī)選取一株自交授粉后24 小時(shí)的玉米果穗，平齊剪去距穗軸頂部1 cm 以上的苞葉和花絲，將其分成兩份，將混有熒光染料（GeneFinderTM）供體高粱的總DNA 溶液滴在一份剪齊的花絲上，每穗滴0.5 mL。分別于8、22 h 采摘若干花絲與未加入染料的授粉花絲（CK）通過紫外成像儀進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源DNA 導(dǎo)入8 h 后對(duì)導(dǎo)入路徑觀察

從圖1 可以看出，未進(jìn)行外源DNA 導(dǎo)入的花絲通過紫外成像儀可觀察到，花絲整體灰暗且分布均勻一致，說明花粉蛋白要與柱頭蛋白已經(jīng)相互識(shí)別，經(jīng)過一段時(shí)間后，將會(huì)萌發(fā)出花粉管，當(dāng)授粉8 h 后玉米花絲已形成花粉管通道，但卻無外源DNA 導(dǎo)入，因此花絲較暗；而被滴入含有GeneFinderTM的外源DNA 的花絲在接近滴入口1～3 cm 處的位置有亮點(diǎn)出現(xiàn)，說明外源導(dǎo)入8 h 后含有GeneFinderTM 外源DNA 已經(jīng)滲入到了花粉管通道中，此時(shí)正從滴入口沿花粉管通道向胚囊方向運(yùn)行。由于玉米授粉后花絲個(gè)體之間的差異，外源DNA 導(dǎo)入后并非所有花絲滴入口均能呈現(xiàn)亮點(diǎn)，因此圖中2 號(hào)花絲通過外源DNA 導(dǎo)入技術(shù)后整體花絲仍較暗，說明2 號(hào)花絲沒有成功導(dǎo)入外源DNA。

圖1 外源導(dǎo)入8 h 后的花絲對(duì)比結(jié)果Fig.1 Contrast result of filament after 8 h outside introduction

2.2 外源DNA 導(dǎo)入22 h 后對(duì)導(dǎo)入路徑觀察

從圖2 可以看出，未進(jìn)行外源DNA 導(dǎo)入的花絲通過紫外成像儀觀察仍呈現(xiàn)整體灰暗的現(xiàn)象，說明沒有外源DNA 導(dǎo)入的花絲在授粉后的任何時(shí)期內(nèi)在亮度上都不會(huì)發(fā)生太大的變化；而被滴入含有GeneFinderTM的外源DNA 的花絲，從整體上看亮度幾乎分布均勻一致（3 號(hào)花絲因外力碾壓，所以花絲表面部分萎蔫），說明授粉22 h 后含有GeneFinderTM外源DNA 正沿花粉管通道向胚囊方向運(yùn)行了很長(zhǎng)距離。

圖2 外源導(dǎo)入22h 后的花絲對(duì)比結(jié)果Fig.2 Contrasting result of filament after 22 h outside introduction

3 討論與結(jié)論

3.1 花粉管通道形成的過程

在溫度為25～30℃以及相對(duì)濕度為85%以上的情況下，玉米花粉落到花絲上10 min 以后就開始發(fā)芽，30 min 左右大量發(fā)芽[7]?；ǚ鬯希M(jìn)而釋放花粉蛋白與柱頭蛋白相互識(shí)別，親和的花粉便可以萌發(fā)產(chǎn)生花粉管?；ǚ酃芡ㄟ^花柱而達(dá)子房的生長(zhǎng)途徑可分為兩種不同的情況：一些植物的花柱中間成空心的花柱道，花粉管在生長(zhǎng)時(shí)沿著花柱道表面下伸，到達(dá)子房；另一種情況是花柱并無花柱道，而為特殊的引導(dǎo)組織或一般薄壁細(xì)胞所充塞，花粉管生長(zhǎng)時(shí)需經(jīng)過酶的作用，將引導(dǎo)組織或薄壁組織細(xì)胞的中層果膠質(zhì)溶解，花粉管經(jīng)由細(xì)胞之間通過?；ǚ酃艿竭_(dá)子房以后，在子房壁內(nèi)表皮和胎座的表面生長(zhǎng)，遇到珠柄后，沿珠柄轉(zhuǎn)向胚珠表面生長(zhǎng)，到達(dá)珠孔處，花粉管經(jīng)珠孔進(jìn)入胚囊[8]。

目前在花粉管通道導(dǎo)入技術(shù)成敗的關(guān)鍵因素中，最主要的是外源DNA 的導(dǎo)入路徑和導(dǎo)入后的整合問題，而花粉管是連接柱頭與胚囊之間唯一的結(jié)構(gòu)，又因其栓塞結(jié)構(gòu)的存在，使得花粉管成為一個(gè)不連續(xù)的系統(tǒng)，所以它不可能運(yùn)轉(zhuǎn)外源DNA，而花粉管的外表面則可成為溶液物質(zhì)轉(zhuǎn)移的唯一連續(xù)界面，此時(shí)外源DNA 溶液就會(huì)沿著連接柱頭與胚囊的花粉管外界面滲入胚囊。從某種意義上來講，外源DNA溶液的導(dǎo)入部位離胚囊越近，越有利于外源DNA 的滲入，為此花粉管必須先形成，而后才能導(dǎo)入外源DNA。但事實(shí)上，由于玉米授粉后花絲個(gè)體之間的差異，該導(dǎo)入技術(shù)并非使玉米的全部花絲均能成功導(dǎo)入外源DNA，因此，只能說在嚴(yán)格規(guī)定導(dǎo)入時(shí)間及技術(shù)手段的前提下，外源DNA 導(dǎo)入技術(shù)能成功導(dǎo)入絕大部分玉米花絲。

3.2 花粉管通道導(dǎo)入路徑的研究進(jìn)展

龔蓁蓁等[9]將花粉管通道的轉(zhuǎn)化機(jī)理歸結(jié)為棉花受精時(shí)所形成的自珠孔到胚囊之間的花粉管通道，外源DNA 由此通道進(jìn)入胚囊。鄧德旺等[10]認(rèn)為，外源DNA 導(dǎo)入的途徑為花粉管外通道，經(jīng)胎座上部傳輸組織束中的花粉管外縫隙胎座表面、珠孔、珠心通道進(jìn)入胚囊。曾君祉等[11]認(rèn)為，外源DNA 引入運(yùn)行的花粉管內(nèi)，使之有機(jī)會(huì)參與受精過程，達(dá)到轉(zhuǎn)化的目的?；ǚ酃苌L(zhǎng)途徑的有關(guān)組織結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果表明，通過花粉管的生長(zhǎng)可以產(chǎn)生所謂的花粉管通道。

3.3 結(jié)論

本文運(yùn)用一種新的試驗(yàn)方法，通過熒光染料與dsDNA 結(jié)合在紫外成像儀下呈現(xiàn)綠色熒光的特點(diǎn)，來觀察授粉后不同時(shí)期外源DNA 在花絲內(nèi)通過路徑的變化。以授粉的玉米花絲為對(duì)照，外源導(dǎo)入8 h后外源DNA 從滴入口方向開始向胚囊方向運(yùn)行，而外源導(dǎo)入22 h 后整個(gè)花絲都呈現(xiàn)亮度整體一致的現(xiàn)象，說明此時(shí)外源DNA 已向胚囊方向運(yùn)行了很長(zhǎng)一段距離，經(jīng)過一段時(shí)間后，可能到達(dá)子房，這與劉金元等[12]的試驗(yàn)結(jié)論一致。

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［5］ 周光字，翁堅(jiān)，龔蓁蓁，等.農(nóng)業(yè)分子育種—授粉后外源DNA 導(dǎo)入植物的技術(shù)［J］. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，1988，21（3）:5-6.

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