玉米胚芽蛋白酶解工藝條件優(yōu)化研究

丁繼峰，張東杰

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院，大慶163319；2.黑龍江省友誼縣食品藥品監(jiān)督管理局）

玉米胚芽中含有豐富的脂肪和蛋白成分，玉米胚芽脫脂后得到的殘渣約含有23%～35%的粗蛋白。玉米胚芽蛋白是一種良好的蛋白資源，有著廣闊的發(fā)展?jié)摿?。玉米胚芽蛋白富含人體所必需的氨基酸，其氨基酸組成及生物效價與雞蛋白相似，高于一般的谷物蛋白，與WHO/FAO推薦的人類蛋白質(zhì)標準值相近，營養(yǎng)價值較高且價格低廉，是一種可以替代大豆蛋白的理想優(yōu)質(zhì)蛋白資源[1-2]。

玉米胚芽蛋白具有良好的持水性、持油性和乳化性，添加到食品中可以改善食品的質(zhì)地及組織特性。目前多采用堿溶酸沉法從玉米胚芽中提取玉米胚芽蛋白，吳冬青、張鳴鏑和李寶玉等人通過數(shù)學模型條件優(yōu)化提取玉米胚芽蛋白的最佳條件，考察加水量、pH、溫度、浸提時間對玉米胚芽蛋白提取的影響[3-6]。連玉新等用中性蛋白酶水解大豆分離蛋白大豆分離蛋白質(zhì)量分數(shù)為5.6%、酶用量為5 000 U·mL-1、反應溫度為51℃、反應時間為117min，該條件下得到改性后大豆分離蛋白的乳化活性為1.390[7]。翟愛華等人利用堿溶酸沉法制備南瓜籽芽蛋白粉的工藝條件。實驗結(jié)果表明:制備南瓜籽芽分離蛋白的最佳條件為液料比40∶1、提取溫度43℃、提取時間2 h、pH10.6。該條件下預測蛋白純度達到96.64%，實際測得蛋白純度為94.79%[8]。近年來，國內(nèi)多用酶解技術(shù)分離植物蛋白多肽，水解制備得到的肽提取效率高，食用安全性高。常用采用單一蛋白酶或者幾種酶聯(lián)合復配。試驗采用木瓜蛋白酶對玉米胚芽蛋白進行酶解，并對酶水解的溫度、pH、酶解時間、酶添加量等水解條件進行探討，旨在優(yōu)化得出玉米胚芽蛋白的最佳水解參數(shù)。

1 實驗材料與實驗方法

1.1 實驗原料

自制玉米胚芽蛋白粉：蛋白質(zhì)純度61.86%。

1.2 實驗儀器

電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；DJIC-60W精密定時電動攪拌器：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；DELTA 320酸度計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司制造；DK-S24電熱恒溫水浴鍋：上海森信實驗儀器有限公司；RE52-98旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水真空泵：鞏義市英裕予華儀器廠；電熱恒溫鼓風干燥箱：上海森信試驗儀器有限公司；萬能粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；DZF-6020真空冷凍干燥機：上海一恒科學有限公司；LD4-8離心機：北京京立離心機有限公司。

1.3 實驗試劑

氫氧化鈉、鹽酸（分析純）、木瓜蛋白酶（NOVO公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗原料預處理

實驗室通過超臨界CO2萃取制備脫脂玉米胚芽粉，再經(jīng)過堿溶酸沉法提取玉米胚芽蛋白備用。

1.4.2 工藝流程

玉米胚芽蛋白→與水混合→調(diào)節(jié)pH→加入木瓜蛋白酶→水解→記錄耗減量→水解度測定

1.4.3 水解度的測定

水解度的測定采用pH-Stat法，水解度的計算公式按下式計算：

式中：h——單位質(zhì)量蛋白質(zhì)中被水解的肽鍵的量（mmoL·g-1）；

htot——單位質(zhì)量蛋白質(zhì)中肽鍵的總量（mmoL·g-1），玉米胚芽蛋白htot=8.38mmoL·g-1；

B——水解過程中所消耗的堿量（mL）；

Nb——堿液的濃度（moL·L-1）；

MP——水解液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量（g）；

1/α——校正系數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 玉米胚芽蛋白水解單因素試驗

2.1.1 木瓜蛋白酶添加量對玉米胚芽蛋白水解效果的影響

圖1 酶添加量對水解度的影響Fig.1 Effectof enzyme concentration on hydrolysis

木瓜蛋白酶添加量對玉米胚芽蛋白水解效果的影響趨勢如圖1所示，隨著木瓜蛋白酶添加量的逐漸增大，玉米胚芽蛋白水解度也逐漸增大，[E]/[S]值小于2%時，玉米胚芽蛋白水解物的水解度增大較快，但[E]/[S]值大于2%后，對玉米胚芽蛋白水解效果的影響差別較小，基本趨于平衡，說明繼續(xù)加大酶添加量不能使酶促進程加快，從經(jīng)濟角度衡量，選擇酶添加量為2%較為合適。

2.1.2 水解溫度對玉米胚芽蛋白水解效果的影響

圖2 水解溫度對水解度的影響Fig.2 Effectof temperature concentration on hydrolysis

水解溫度對玉米胚芽蛋白水解效果的影響趨勢如圖2所示，隨著水解溫度的升高，玉米胚芽蛋白水解度先迅速增大后逐漸減小，在水解溫度為60℃時，水解度達到最大，繼續(xù)溫度繼續(xù)升高，水解度反而降低，由此說明水解溫度較低時，木瓜蛋白酶活性較低，不能與底物完全結(jié)合發(fā)生反應，而溫度過高不但會使酶失活，同時也會使部分玉米胚芽蛋白發(fā)生變性，使得反應底物減少，從而導致反應速率下降，因此，木瓜蛋白酶水解的最佳溫度為60℃。

2.1.3 水解時間對玉米胚芽蛋白水解效果的影響

圖3 水解時間對水解度的影響Fig.2 Effectof time concentration on hydrolysis

水解時間對玉米胚芽蛋白水解效果的影響趨勢如圖3所示，隨著水解時間的延長，玉米胚芽蛋白水解度逐漸增大，在3 h后基本達到平衡，由圖可以看出水解時間對玉米胚芽蛋白水解物的水解度影響較為顯著，隨著水解時間的延長，木瓜蛋白酶與底物充分接觸，酶解反應完全，肽鍵斷裂較完全。因此，木瓜蛋白酶水解的最佳時間為3 h。

2.1.4 水解pH對玉米胚芽蛋白水解效果的影響

圖4 pH對水解度的影響Fig.4 Effectof pH concentration on hydrolysis

不同pH對玉米胚芽蛋白水解效果的影響趨勢如圖4所示，隨著pH的增大，玉米胚芽蛋白水解度變化顯著，pH為6.5時，玉米胚芽蛋白水解物的水解度最大，pH過大或者過小都不利于木瓜蛋白酶的酶解效果，使酶促反應不能正常進行，與此同時，pH的改變也可能使得玉米胚芽蛋白的結(jié)構(gòu)狀態(tài)發(fā)生改變。因此，木瓜蛋白酶酶解的最適pH為6.5。

2.2 玉米胚芽蛋白水解條件的優(yōu)化

根據(jù)以上單因素試驗的結(jié)果進行四元二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設計實驗，并采用SAS軟件對結(jié)果進行處理分析，試驗設計及結(jié)果見表1。

表1 試驗設計及結(jié)果Table1 Design and results of experiment

續(xù)表1試驗設計及結(jié)果Continued Table1 Design and results of experiment

對實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，以玉米胚芽蛋白水解物的水解度作為衡量指標即Y值，得到以四種影響因素的編碼值為自變量的回歸方程如下：

回歸方程的方差分析及F檢驗結(jié)果見表2：

表2 F檢驗分析表Table2 F testanalysis

回歸方程顯著性分析結(jié)果：F回歸=40.61＞F0.01=3.03，說明差異極顯著。F失擬=1.80＜F0.05=2.85，說明差異不顯著；對回歸方程顯著性檢驗：R2=S回/S總=0.964 4?；貧w方程的擬合性較好。對回歸方程進行模擬尋優(yōu)，得到水解玉米胚芽蛋白的最佳條件為：木瓜蛋白酶添加量2.09%，水解溫度60.05℃，水解時間2.99 h，pH6.42，理論水解度為13.65%。根據(jù)實際操作情況，選擇在木瓜蛋白酶添加量2.1%，水解溫度60℃，水解時間3 h，pH6.4條件下進行三次驗證，實際水解度平均值為13.52%，誤差為≤5%，說明優(yōu)化模型擬合較好。

3 結(jié)論

試驗采用木瓜蛋白酶對玉米胚芽蛋白進行水解，以水解度為衡量指標，考察了木瓜蛋白酶的添加量、水解溫度、水解時間和pH四個單因素對玉米胚芽蛋白水解效果的影響，兵在單因素基礎上進行四元二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設計實驗，經(jīng)過優(yōu)化級實際操作情況，最終確定玉米胚芽蛋白水解的最佳條件為：木瓜蛋白酶添加量2.1%，水解溫度60℃，水解時間3 h，pH6.4，此實驗條件驗證，實際水解度為13.52%。

[1]Brown L M，Zayas J.F.Corn germ protein flour as an extender in broiled beef patties[J].Journal of food science，1990，55：888-892.

[2]Kulakova E V，Vainerman E S，Rogoshin SV.Contribution to the investigation of the corn germ Part I.Corn germ as a valuable source of protein[J].Nahrung，1982，26：451-456.

[3]吳冬青，于丹丹，后麗麗，等．堿法提取玉米胚蛋白工藝的研究[J]．糧油食品科技，2006，14（1）：36-37.

[4]張鳴鏑，姚惠源．提高玉米胚蛋白浸出率的工藝研究[J]．農(nóng)業(yè)工程學報，2006，22（5）：226-228.

[5]李寶玉，代小容．玉米胚分離蛋白提取及影響收率因素的初探[J]．山東食品發(fā)酵，2008（3）：16-18.

[6]張鳴鏑，王章存．響應面分析法優(yōu)化玉米胚芽蛋白的提取工藝研究[J]．農(nóng)產(chǎn)品加工：學刊，2008（7）：174-177.

[7]連玉新，張東杰，王穎．響應面法優(yōu)化酶改性大豆分離蛋白條件的研究[J]．黑龍江八一農(nóng)墾大學學報，2012，24（2）：65-70.

[8]翟愛華，王迪，王憲青，等．響應面法優(yōu)化南瓜籽芽蛋白粉的堿法制備工藝[J]．黑龍江八一農(nóng)墾大學學報，2011，23（5）：69-75.