具有大孔介孔結(jié)構(gòu)的磷酸鈦的合成及溶菌酶吸附

李 霞，邢向英，任鐵真

（河北工業(yè)大學(xué) 化工學(xué)院，天津 300130）

生物大分子的吸附和固載在生物、醫(yī)藥、生態(tài)學(xué)和食品工業(yè)方面具有廣泛的應(yīng)用前景[1]，許多多孔材料用來(lái)蛋白質(zhì)吸附[2-7].

溶菌酶（Lysozyme）是一個(gè)橢球型的蛋白質(zhì)分子包括了兩個(gè)特征性的截面：其中的橫截面的面積約為3.0×4.5 nm2，縱截面的面積約為3.0×3.0 nm2[8,9].由于溶菌酶的簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)特征，目前介孔材料吸附溶菌酶的研究備受關(guān)注[2-4].Vinu[2]曾系統(tǒng)的考察過(guò)不同的介孔氧化硅材料對(duì)溶菌酶的吸附性能，A lSBA-15在等電點(diǎn)處的最大吸附量為47.2mol/g，比表面積為1 000 m2/g的MCM-41在等電點(diǎn)處的最大吸附量為28.1.而介孔磷酸鋁和多孔炭材料吸附溶菌酶的報(bào)道顯示，介孔磷酸鋁的吸附量?jī)H為11，介孔炭材料的為22[4-6].在眾多介孔材料中，磷酸鈦對(duì)溶菌酶的吸附研究較少，而介孔磷酸鈦因穩(wěn)定性高、生物友好等優(yōu)點(diǎn)，更適合生物大分子的吸附、運(yùn)載和固化.

最近，人們使用陰離子表面活性劑，陽(yáng)離子表面活性劑，烷基銨，嵌段共聚物等作為模板劑合成出了類分子篩微孔磷酸鈦[10]，介孔磷酸鈦等材料[11-15].盡管使用表面活性劑模板，聚合物模板，生物模板或無(wú)模板自組裝等方法可以合成出具有多級(jí)孔道結(jié)構(gòu)介孔磷酸鈦，但是設(shè)計(jì)和合成出具有大孔-介孔結(jié)構(gòu)的磷酸鈦材料仍然具有很大的困難.在介孔材料中引入大孔結(jié)構(gòu)，對(duì)于那些擴(kuò)散速率低的大分子反應(yīng)（如高分子、生物分子）或粘性體系尤其重要，且大孔和介孔要很好的相互貫通，以更大的提高材料的性能.本文采用混合表面活性劑合成了大孔-介孔結(jié)構(gòu)的磷酸鈦材料，在表面活性劑存在下的油/水混合體系可以形成微乳泡，在微乳泡外圍氧化物先驅(qū)體與表面活性劑作用組成介孔結(jié)構(gòu)的骨架墻，所得固體產(chǎn)物經(jīng)焙燒去除表面活性劑等有機(jī)組分后即生成大孔-介孔復(fù)合結(jié)構(gòu)材料[16]，并考察了合成材料對(duì)溶菌酶的吸附性能，經(jīng)測(cè)定表明溶菌酶以無(wú)規(guī)則排列的單層吸附形式為主，合成的材料是一種很好的吸附劑.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 大孔-介孔磷酸鈦的制備

將一定物質(zhì)的量之比的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB） 和烷基酚聚氧乙烯醚（OP-10）混合物溶于乙醇溶劑中，60℃下攪拌一定的時(shí)間，然后加入磷酸，同溫度下攪拌30 m in，最后向混合物中滴加鈦酸四丁酯，得到白色的凝膠，混合物物質(zhì)的量之比大約為0.02OP-10∶0.1CTAB∶1TBOT∶1H3PO4∶100C2H5OH，攪拌3h后，將混合物轉(zhuǎn)入帶有聚四氟乙烯內(nèi)襯的不銹鋼反應(yīng)釜內(nèi)，放入90℃的恒溫干燥箱內(nèi)老化兩天，兩天后把混合物取出過(guò)濾，60℃恒溫干燥箱內(nèi)干燥，在馬弗爐內(nèi)程序升溫到500℃焙燒4 h，收集樣品TiP01.改變?nèi)軇?(C2H5OH)∶ (H2O)=1∶2，其它步驟同上，合成的樣品標(biāo)記為T(mén)iP02.

1.2 表征

采用日本理學(xué)Rigaku D/Max 2500型X射線衍射儀分析催化劑的物相結(jié)構(gòu)，CuK輻射，管電壓40 kV，管電流100mA.FT-IR數(shù)據(jù)由瑞士Bruker公司VECTOR22型傅立葉紅外光譜儀所得；儀器分辯率為4 cm1；掃描速度：0.2 cm s1；波數(shù)范圍：400～4000 cm1.試樣制備采用KBr壓片法.N2吸附數(shù)據(jù)采用國(guó)康塔儀器公司生產(chǎn)的NOVA2000e高速比表面和孔隙度儀進(jìn)行測(cè)定，N2為吸附質(zhì)，吸附溫度為液氮溫度，比表面用BET方程進(jìn)行計(jì)算.TEM分析采用PhilipsTECNAIG20型透射電鏡TEM加速電壓200 kV點(diǎn)分辨率0.2nm.SEM分析是在JSM-6700F掃描電鏡上觀察產(chǎn)物形貌，工作電壓為20 kV.將制得的粉末樣品用導(dǎo)電膠固定在金屬片上進(jìn)行測(cè)試.

1.3 溶菌酶吸附

通過(guò)把不同量的溶菌酶加入到25mol/L緩沖溶液（pH=6.5的磷酸鉀緩沖溶液和pH=9.6的碳酸鈉緩沖溶液）中，配置一系列濃度從20～280mol/L的溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)溶液.每一次吸附實(shí)驗(yàn)按如下步驟進(jìn)行：50mg不同的磷酸鈦材料吸附劑分散在10m L不同濃度的溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)液中，最終的混合物在293K攪拌直到吸附達(dá)到平衡（24 h）.溶菌酶的吸附量由標(biāo)準(zhǔn)溶液的量減去吸附后溶液中剩下的量來(lái)計(jì)算.溶菌酶的UV吸附在，在進(jìn)行UV-Vis分析前離心分離，取上層清液以避免分散的懸浮小顆粒對(duì)結(jié)果的影響.

2 結(jié)果與討論

2.1 磷酸鈦的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)表征

圖1是樣品TiP01和TiP02的廣角X-射線衍射譜圖，從圖上可以明顯的看出兩個(gè)樣品具有相似結(jié)構(gòu)，在15°～40°處有一個(gè)寬峰，說(shuō)明合成樣品主要為無(wú)定形非晶態(tài)形式.

圖2是樣品TiP01和TiP02的SEM圖和TEM圖.圖2a,b是合成樣品TiP01的SEM圖，從圖中可以看出TiP01是由不規(guī)則的納米顆粒聚集而成，顆粒大小大約幾百個(gè)納米，為介孔結(jié)構(gòu)并沒(méi)有大孔的存在.改變合成的溶劑，鈦酸四丁酯在有表面活性劑存在下的油/水混合體系形成的微乳泡外圍水解，組成介孔結(jié)構(gòu)的骨架墻，所得固體產(chǎn)物經(jīng)焙燒去除表面活性劑等有機(jī)組分后即生成大孔-介孔復(fù)合結(jié)構(gòu)材料.圖2c,d是TiP02的SEM圖，從圖中可以看出TiP02具有孔徑1～2m的大孔結(jié)構(gòu)存在，大孔孔道呈一維平行排列，大孔孔墻是由許多相互連接的球形小粒子組成的，它們之間的相互堆積和聚集又進(jìn)一步形成了大孔孔墻之間的幾百個(gè)納米大小的孔道.圖2 e,f是合成樣品TiP01的TEM圖，從圖中可以看出鈦酸四丁酯醇解的過(guò)程中形成了蠕蟲(chóng)狀的納米孔，納米顆粒的聚集形成了介孔，孔徑大約為5 nm.圖2h,g為T(mén)iP02的TEM圖，圖中顯示TiP02大孔孔墻是由氧化鈦納米顆粒堆積組成的，它們之間有蠕蟲(chóng)狀的介孔結(jié)構(gòu)，孔徑大約為6 nm，還有一些10 nm左右的大孔，這種蠕蟲(chóng)狀的介孔結(jié)構(gòu)是有納米粒子之間有組織的聚集和堆積構(gòu)成[17].XRD和SEM分析顯示，合成體系中水的加入對(duì)樣品孔結(jié)構(gòu)有明顯的作用，是制備大孔結(jié)構(gòu)磷酸鈦的關(guān)鍵.但是，對(duì)樣品的無(wú)定形結(jié)構(gòu)沒(méi)有影響.

2.2 溶菌酶吸附性能研究

在不同的pH下，介孔磷酸鈦吸附緩沖溶液中的溶菌酶，吸附量與溶液的pH，孔容和吸附劑的成分都有一定關(guān)系，最大的吸附量在等電點(diǎn)處（p I=11），圖3是TiP01在不同pH下的等溫線，從圖中可以看出，初始吸附量呈直線上升，最終在較高的平衡濃度時(shí)出現(xiàn)吸附平臺(tái).溶菌酶和吸附劑之間表現(xiàn)了很強(qiáng)的吸附力，這些等溫線符合典型的朗繆爾單層吸附，單層吸附容量可以通過(guò)吸附等溫式計(jì)算得出

關(guān)于溶菌酶的吸附機(jī)理，主要從3個(gè)方面來(lái)討論，大于等電點(diǎn)，等于等電點(diǎn)，小于等電點(diǎn)，溶菌酶在低于等電點(diǎn)（在適當(dāng)?shù)乃釅A度時(shí)，氨基酸的氨基和羧基的解離度基本相等，正離子等于負(fù)離子，凈電荷為零，這時(shí)溶液的pH值稱為該溶液的等電點(diǎn)）pHlt;11，溶菌酶帶正電荷，高于等電點(diǎn)時(shí)帶負(fù)電荷，溶菌酶帶負(fù)電荷.在溶菌酶的吸附方面，疏水作用和靜電作用都是重要的作用力.在等電點(diǎn)處溶菌酶的凈電荷為零，溶菌酶分子之間的排斥力達(dá)到最低，另外疏水作用相對(duì)于靜電作用在等電點(diǎn)處更占優(yōu)勢(shì)，因此在等電點(diǎn)處溶菌酶的吸附達(dá)到了最大，最大吸附量為25.94mol/g.隨著pH從11降到6.5，溶菌酶的正電荷開(kāi)始增加，溶菌酶分子之間排斥作用增大，分子面積變大，占據(jù)了更大的空間，因此溶菌酶和吸附劑之間的靜電作用力有所降低，從而吸附量降低.所以，在pH低于等電點(diǎn)時(shí)，單層吸附容量低于在等電點(diǎn)時(shí)的吸附容量.當(dāng)溶液的pH=12時(shí)，溶菌酶分子的表面帶負(fù)電荷，蛋白質(zhì)分子之間靜電排斥作用力增加了，同理，這吸附容量也降低了.通過(guò)上面的分析，我們得出，在等電點(diǎn)處疏水作用相對(duì)于靜電作用更占優(yōu)勢(shì)，然而，在低于等電點(diǎn)和高于等電點(diǎn)處，對(duì)于蛋白質(zhì)吸附在吸附劑上，靜電作用力更占優(yōu)勢(shì).

圖4為兩種不同孔徑的磷酸鈦材料在pH=11緩沖溶液中的溶菌酶吸附曲線，在平衡濃度范圍內(nèi)，不同的吸附劑有不同的吸附能力，順序?yàn)椋篢iP01gt;TiP02，最大吸附量分別為25.94mol/g和21.07mol/g.對(duì)于TiP01而言，它具有比較大的比表面積，有更多的活性中心，有利于溶菌酶分子分散在吸附劑的表面，由于溶菌酶吸附為單層吸附，較大的比表面積對(duì)于溶菌酶在氧化鈦材料表面的吸附尤為重要，TiP01具有比TiP02更大的比表面積，所以它的吸附能力更強(qiáng)一些.雖然TiP02相對(duì)于TiP01的比表面積降低了很多，TiP02的大孔有利于溶菌酶分子進(jìn)入孔內(nèi)并在其中進(jìn)行分散從而覆蓋所有的表面，所以吸附量降低的并不是很多，因此影響吸附的因素不僅與比表面積有關(guān)，還與材料的自身的性質(zhì)、成分及形貌有關(guān).

圖5為樣品傅立葉紅外譜分析圖譜，3 400 cm1和1 630 cm1處的振動(dòng)峰可以歸屬于表面羥基和表面吸附水的伸縮振動(dòng)峰.未焙燒前得FT-IR圖，從圖中可以看出2 922 cm1和2 850 cm1處的特征峰是有亞甲基中的C-CH2伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的，而1463 cm1和1 363 cm1是有表面活性劑中的C-H鍵的伸縮振動(dòng)峰，另外，1712 cm1的振動(dòng)峰是有OP-10中的芳環(huán)所引起的.在紅外譜圖中，低頻段的400～790 cm1的峰是典型的Ti-O-Ti的骨架振動(dòng)峰[18].500℃焙燒后，C-H鍵特征峰的消失，表明了表面活性劑通過(guò)焙燒后被完全去除.在～1040 cm1處較強(qiáng)的振動(dòng)峰，歸屬于，或者Ti-O-P的骨架振動(dòng)的特征峰[20]，Vasylvev等人[21]通過(guò)對(duì)磷酸鈦材料的FT-IR研究發(fā)現(xiàn)，在1 026 cm1處可以觀測(cè)到新的振動(dòng)峰，此處的峰位歸屬于具有樹(shù)枝狀的磷酸根與鈦相連形成的P O T i骨架振動(dòng).而B(niǎo)haum ik和Inagaki[12]認(rèn)為在1 000～1 050 cm1的振動(dòng)峰主要是由Ti-O-P骨架振動(dòng)所致.吸附溶菌酶后（圖5 c），溶菌酶分子的特征峰可以被全部觀測(cè)到.1650 cm1為氨基化合物的C=O伸縮振動(dòng)峰.1 530 cm1為N H和C N的彎曲振動(dòng)和伸縮振動(dòng)[22].1 430 cm1和1 363 cm1可以歸屬為氨基酸鏈上的脂肪族的CH2和CH3振動(dòng)模式.1 225 cm-1歸屬于氨基酸 -層的貢獻(xiàn)[22-24].紅外分析顯示，溶菌酶分子的基本氨基酸序列沒(méi)有變化，說(shuō)明磷酸鈦對(duì)溶菌酶的吸附?jīng)]有引起蛋白質(zhì)的變性.

圖6是對(duì)合成的樣品TiP01，TiP02和TiP01XFH進(jìn)行氮?dú)馕?脫附等溫線和DFT法計(jì)算得到的孔徑分布圖.根據(jù)國(guó)際純粹和應(yīng)用化學(xué)學(xué)會(huì)（IUPAC）的分類.從吸附等溫線可以看出，所得的所有樣品的等溫線均屬于IV型吸附等溫曲線，表明材料具有典型的介孔結(jié)構(gòu)，TiP01的比表面積為272 m2/g，而TiP02的比表面積為162 m2/g，從吸附等溫線上可以直接看出TiP02的比表面積相對(duì)于TiP01有所降低.在對(duì)應(yīng)的孔徑分布圖上可以看出TiP01的孔徑3.7 nm，孔容為0.359 cm3/g，而TiP02的孔徑為5.4nm，孔容為0.388 cm3/g，TiP02的孔徑相對(duì)于TiP01的孔徑有所增加，還有一部分10nm以上的孔.樣品TiP01吸附溶菌酶后吸附脫附等溫線上的可以看出明顯的滯后環(huán)，所以吸附溶菌酶后TiP01樣品的介孔結(jié)構(gòu)仍然存在，說(shuō)明溶菌酶吸附并沒(méi)有影響樣品的介孔結(jié)構(gòu)，但比表面面積降低了很多，吸附前的比表面積為272m2/g，吸附后的比表面積為109m2/g，比表面積降低了163m2/g，孔容為0.109 cm3/g，孔徑保持4 nm左右.

表1 合成樣品的各項(xiàng)結(jié)構(gòu)參數(shù)Tab.1 Texturalpropertiesof the synthesized samples

目前，文獻(xiàn)中報(bào)道的介孔氧化硅、多孔碳等材料，其比表面積均遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于磷酸鈦材料，但是，對(duì)溶菌酶的吸附能力卻與磷酸鈦材料相近[2-6]，表明對(duì)蛋白質(zhì)吸附材料的選取，應(yīng)當(dāng)在考慮比表面積和孔徑大小的同時(shí)，注意材料的生物友好性.同時(shí)，結(jié)合TiP01吸附前后比表面的減少163 m2/g，根據(jù)溶菌酶的特定分子結(jié)構(gòu)和三維尺度，吸附量相對(duì)應(yīng)的比表面積可以由方程得到.其中分別帶入溶菌酶的橫截面積和縱截面積，n為阿伏加德羅常數(shù)6.02×1023）.因此，吸附量對(duì)應(yīng)的面積為140～210m2/g（TiP01），表明溶菌酶分子在吸附劑表面為單層吸附無(wú)規(guī)則方式的排列，計(jì)算結(jié)果與測(cè)試結(jié)果基本一致.

3 結(jié)論

利用CTAB和OP-10混合模板體系，在水熱條件下制備出大孔-介孔結(jié)構(gòu)磷酸鈦和介孔磷酸鈦氧化物，在乙醇溶劑的條件下合成的介孔磷酸鈦TiP01，比表面積可以達(dá)到272 m2/g，通過(guò)氮?dú)馕降葴鼐€可以看出為介孔材料.通過(guò)改變?nèi)軇?，合成出大?介孔磷酸鈦TiP02，由SEM圖可以看出大孔孔徑為1～2 m.對(duì)合成的材料進(jìn)行溶菌酶吸附性能測(cè)試，在平衡吸附濃度范圍內(nèi)，最大的吸附量發(fā)生在等電點(diǎn)處，在等電點(diǎn)處TiP01溶菌酶的最大吸附量為25.94mol/g，TiP02的最大吸附量為21.07mol/g，在溶菌酶的等電處，氨基酸殘基之間的庫(kù)倫排斥力最小，溶菌酶分子之間緊密堆積，從而體積最小，有利于吸附劑的吸附.通過(guò)比較不同孔徑的介孔磷修飾的氧化鈦材料對(duì)溶菌酶的吸附曲線，可以看出，吸附劑的比表面積越大越有利于溶菌酶吸附，吸附劑的吸附能力就越大.

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