美洲斑潛蠅SS-PCR檢測技術(shù)研究

張桂芬，劉萬學(xué)，郭建英，呂志創(chuàng)，萬方浩，申香菊中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室，北京009;農(nóng)業(yè)部外來入侵生物預(yù)防與控制研究中心，北京0008;北京市順義區(qū)植保植檢站，北京000

美洲斑潛蠅Liriomyza sativae Blanchard，屬雙翅目潛蠅科斑潛蠅屬，是一種世界性檢疫害蟲。歐洲和地中海植物保護組織 (European and Mediterranean Plant Protection Organization，EPPO)將其列為A2 類檢疫性有害生物(http:∥www.eppo.org/);我國農(nóng)業(yè)部于1995年將其列為進境地植物檢疫潛在性害蟲，并制定了美洲斑潛蠅“九五”監(jiān)測治理規(guī)劃(陳文龍和張潤杰，2003)。美洲斑潛蠅為多食性害蟲，寄主廣泛，如僅在北京地區(qū)其寄主已涉及20科130多種植物(雷仲仁和王音，2005)。

美洲斑潛蠅原產(chǎn)于巴西，20世紀40年代以來陸續(xù)暴發(fā)于佛羅里達、夏威夷等地，70年代后又于大洋洲的一些島嶼和阿拉伯半島南部地區(qū)發(fā)現(xiàn)該蟲。多年來該蟲隨寄主植物及其他介質(zhì)在世界范圍內(nèi)傳播蔓延，現(xiàn)已在40多個國家和地區(qū)嚴重發(fā)生(EPPO/CABI，2011)。由于美洲斑潛蠅具有繁殖能力強，發(fā)育周期短，寄主范圍廣，能傳播多種植物病毒，可在較短時間暴發(fā)成災(zāi)等特點，許多國家將其列為植物檢疫一類危險性害蟲(Deeming，1992;EPPO/CABI，2011;Zitter ＆ Tsai，1980)。我國于1994年初在海南省三亞市蔬菜上首次發(fā)現(xiàn)美洲斑潛蠅，同年底即在華南、華中等地普遍發(fā)生(問錦曾等，1996)，1997年蔓延至全國25個省/直轄市/自治區(qū);到目前為止，該蟲已廣泛分布于我國29個省/直轄市/自治區(qū)，對瓜果、蔬菜、煙草、棉花等經(jīng)濟作物和花卉造成嚴重危害，已成為我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的一個突出問題(陳兵等，2002;范文中和王中武，2005;胡長效和蘇新林，2003;雷仲仁和王音，2005;王軍等，1999)。因此，加強對美洲斑潛蠅的檢疫和監(jiān)測成為維護我國對外貿(mào)易信譽，保障人民健康生活的必要前提。美洲斑潛蠅以卵和幼蟲藏匿在寄主植物組織內(nèi)，隨切花、切條、帶葉的瓜、果、豆、菜、其他寄主葉片以及盆景植物進行遠距離傳播;蛹隨寄主植株土壤傳播(EPPO/CABI，2011)。因此，要加強對美洲斑潛蠅的檢疫與監(jiān)測必需建立一套快速準確的分子檢測技術(shù)。

目前，世界上的斑潛蠅屬昆蟲約有300種，但真正危害農(nóng)作物的僅有23種(Parrella，1987)，我國已知有14種(楊龍龍，1995)。斑潛蠅屬害蟲體型較小(如美洲斑潛蠅成蟲體長1.3 ～2.3 mm，卵0.2～0.3 mm)，且外部形態(tài)極為相似，卵、幼蟲和蛹更難以從形態(tài)上加以區(qū)分(附錄)。然而，檢疫工作中截獲的斑潛蠅多為卵、幼蟲或蛹。通常斑潛蠅屬害蟲幼期階段多因形態(tài)不穩(wěn)定或特征不明顯而難以鑒定分類，無法及時進行種類識別，為檢疫工作帶來諸多不便(陳萍等，2002;Frick，1952;Sasakawa，1961)，而分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用為檢疫害蟲的及時鑒定提供了快捷而準確的途徑。本研究以重要檢疫害蟲美洲斑潛蠅為靶標，以我國菜田常見潛葉蠅類害蟲，包括南美斑潛蠅Liriomyza huidobrensis Blanchard、三葉斑潛蠅Liriomyza trifolli Brugess、蔥斑潛蠅Liriomyza chinensis Kato、豌豆?jié)撊~蠅Phytomyza horticola Goureau等為參照，采用種特異性PCR(speciesspecific PCR，SS-PCR)進行快速鑒定技術(shù)的研究，旨在為有效阻截美洲斑潛蠅的進一步傳播擴散，保障國家貿(mào)易信譽和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

美洲斑潛蠅飼養(yǎng)于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所南區(qū)溫室，寄主植物為菜豆Phaseolus vulgaris L.;南美斑潛蠅采自云南省昆明市呈貢縣蔬菜生產(chǎn)基地，寄主植物為芹菜Apium graveolens L.;三葉斑潛蠅由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院昆蟲生態(tài)研究室提供;蔥斑潛蠅采自市售大蔥Allium fistulosum L.，產(chǎn)地為山東省章丘市;豌豆?jié)撊~蠅采自北京市密云縣河南寨鄉(xiāng)，寄主植物為二月蘭Orychophragmus violaceus(L.)Schulz。

1.2 潛葉蠅總DNA的制備

參照王莉萍等(2007)和周志湘等(2007)的方法并稍加改動。取美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅、三葉斑潛蠅、蔥斑潛蠅和豌豆?jié)撊~蠅各1頭(粒)，置于滴有20 μL DNA 提取緩沖液(pH 8.0，0.05 mol Tris-HCl、0.001 mol EDTA、0.02 mol NaCl、1%SDS)的Parafilm膜上，用0.2 mL的PCR管底部作為勻漿器充分研磨勻漿，勻漿液用微量移液器移入1.5 mL離心管;然后用100 μL提取緩沖液分2次沖洗勻漿器，并移入同一離心管，混勻;向管中加入8 μL(20 mg·mL-1)蛋白酶K，充分混勻后，于60℃水浴1.5 h(中途混勻1次);然后沸水浴8 min，加入220 μL氯仿/異戊醇(v∶v=24∶1)抽提液，輕柔混勻數(shù)10次后，冰浴30 min;4 ℃、12000 r·min-1離心 20 min，取上清液，加入440 μL預(yù)冷無水乙醇，輕輕混勻，待出現(xiàn)少量絮狀沉淀后于-20℃放置30 min;4℃、12000 r·min-1離心15 min，棄去上清液。加入400 μL 75%預(yù)冷乙醇洗滌，4 ℃、12000 r·min-1離心 15 min，棄去上清液;然后將離心管倒扣于潔凈濾紙上，自然干燥30 min后每管加入30 μL超純水(其中美洲斑潛蠅的蛹以及1～3齡幼蟲以20 μL超純水復(fù)溶，卵以10 μL超純水復(fù)溶)，充分溶解后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 美洲斑潛蠅SS-PCR引物的設(shè)計

在GenBank中調(diào)用已知的美洲斑潛蠅線粒體DNA細胞色素氧化酶亞基I基因(mitochondrial DNA cytochrome oxidase I，mtDNA COⅠ)序列(GenBank 登錄號為 EU219613)(Shang et al.，2008)，運用 Primer Premier 5軟件將美洲斑潛蠅COⅠ序列與其近緣種南美斑潛蠅、三葉斑潛蠅、蔥斑潛蠅的COⅠ序列進行比較分析，選取美洲斑潛蠅與其他潛葉蠅類昆蟲同源性最低的區(qū)段，根據(jù)該區(qū)段的堿基序列設(shè)計1對美洲斑潛蠅特異性引物LSCZE1/LSCZF1，上游引物堿基序列為TCGAGCAGAATTAGGACAT，下游引物堿基序列為ATTGAAGAAAGTGGAGGGT(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司協(xié)助合成)，引物擴增片段大小為294 bp。

1.4 SS-PCR引物的種特異性檢驗

分別以單頭南美斑潛蠅、三葉斑潛蠅、蔥斑潛蠅、豌豆?jié)撊~蠅的DNA為模板，美洲斑潛蠅為陽性對照，檢驗美洲斑潛蠅特異片段擴增引物LSCZE1/LSCZF1的種特異性。PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中超純水 11.4 μL、10 × 緩沖液 2.0 μL、10 mmol·L-1dNTP 0.4 μL、5 U·μL-1L Taq 聚合酶 0.2 μL(美國NEB 公司)、20 ng·μL-1上游引物和下游引物各 2.0 μL、模板DNA 2.0 μL。擴增程序:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃ 60 s，68 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，40 個循環(huán);最后72 ℃延伸5 min。擴增反應(yīng)在ABI-9700 PCR基因擴增儀上運行。取5 μL PCR擴增產(chǎn)物在1.5%(重量)瓊脂糖(amresco)凝膠上以80 V電泳(Bio-Rad Power-Pac Basic)分離 50 min，然后以 GelDoc Universal Hood II型凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories)分析電泳結(jié)果。每個種類分別檢測10頭，并隨機以其他2種型號(Bio-Rad iCycler和 ABI Veriti)的PCR儀進行驗證。

1.5 SS-PCR引物對不同蟲態(tài)的擴增效果以及最低檢測閾值的測定

分別以提取的不同性別(雌性成蟲、雄性成蟲)與蟲態(tài)(卵、1～3齡幼蟲和蛹)的美洲斑潛蠅DNA為模板，進行靶標片段擴增效果檢驗，每種性別或蟲態(tài)分別檢測10頭。此外，取單頭雌性成蟲原模板DNA溶液2 μL(即1/15頭成蟲)以2倍濃度遞減梯度稀釋至1/30720頭成蟲DNA，然后以不同濃度的成蟲 DNA 模板(即 1/15、1/30、1/60、1/120、1/240、1/480、1/960、1/1920、1/3840、1/7680、1/15360、1/30720頭成蟲)進行最低檢出閾值的測定，每個濃度共計檢測10頭。

2 結(jié)果與分析

2.1 美洲斑潛蠅SS-PCR引物的種特異性檢驗

以美洲斑潛蠅及其近緣種屬潛葉蠅類昆蟲的DNA為模板，以所設(shè)計的特異性引物LSCZE1/LSCZF1進行PCR擴增。檢測結(jié)果顯示，該引物只對美洲斑潛蠅具有擴增能力，對其他種類的潛葉蠅沒有擴增能力，表明該引物為美洲斑潛蠅的特異性引物(圖1)。

圖1 SS-PCR引物LSCZE1/LSCZF1對美洲斑潛蠅及其近緣種屬潛葉蠅的PCR擴增結(jié)果Fig.1 Amplification pattern of mitochondrial DNA of L.sativae and its related leafminer species using SS-PCR primers LSCZE1/LSCZF1

2.2 SS-PCR引物對美洲斑潛蠅不同蟲態(tài)的擴增效果

以不同性別和蟲態(tài)的美洲斑潛蠅DNA為模板，以SS-PCR引物LSCZE1/LSCZF1進行擴增，結(jié)果顯示，不同性別與蟲態(tài)的美洲斑潛蠅均能穩(wěn)定擴增出294 bp的特異性片段(圖2)。

2.3 SS-PCR引物對美洲斑潛蠅成蟲的最低檢測閾值

當將單頭雌性成蟲的DNA模板進行遞減梯度稀釋至1/3840頭時，所有的個體均能擴增出特異性的靶標片段;當稀釋為1/7680頭時，仍有60%的個體可擴增出清晰的條帶(圖3)。

圖2 SS-PCR引物LSCZE1/LSCZF1對美洲斑潛蠅不同蟲態(tài)和性別的PCR擴增結(jié)果Fig.2 Amplification pattern of mitochondrial DNA from different developmental stages and sexes of L.sativae using SS-PCR primers LSCZE1/LSCZF1

圖3 SS-PCR引物LSCZE1/LSCZF1對美洲斑潛蠅的最低檢出閾值Fig.3 The detection efficiency for L.sativae，using a dilution series of mitochondrial DNA isolated from a single adult，using the specifically designed SS-PCR primers LSCZE1/LSCZF1

3 討論

種類鑒定是害蟲檢疫的首要工作。目前，斑潛蠅屬昆蟲的識別主要依據(jù)成蟲的形態(tài)特征(Sasakawa，1961;Shiao et al.，1991;Spencer，1986);成蟲前各時期(卵、幼蟲、蛹)的鑒定由于形態(tài)不穩(wěn)定或特征不明顯而無法實施(陳萍等，2002;Frick，1952;Sasakawa，1961)，通常的做法是將其進行室內(nèi)飼養(yǎng)，待羽化后再做鑒定，不僅耗時長，而且常因標本數(shù)量少而使鑒定工作無法完成(邱一中等，2000)。因此，研究開發(fā)快速、簡便、準確且適用于昆蟲不同發(fā)育時期的害蟲鑒定新技術(shù)，是有效阻止危險性害蟲進一步傳播擴散，增強檢驗檢疫和檢測監(jiān)測能力的必要前提。

目前，以分子生物學(xué)技術(shù)進行檢疫性害蟲種類鑒定識別以及檢測監(jiān)測的研究時有報道并逐漸得以推廣應(yīng)用，其中RAPD(random amplification of polymorphic DNA)(邱一中等，2000;??l et al.，2006)、RFLP(restriction fragment length polymorphism)(陳萍等，2002;Scheffer et al.，2001)、多重 PCR(mutiplex PCR)(Miura et al.，2004)以及DNA條形編碼(DNA barcoding)(Scheffer et al.，2006)等技術(shù)均已用于斑潛蠅屬害蟲的鑒定研究，并取得良好成效。但是，RAPD標記技術(shù)對環(huán)境因子的變化較為敏感，擴增產(chǎn)物的可重復(fù)性相對較差，結(jié)果的可靠性低，因此目前已較少使用;RFLP技術(shù)由于所需DNA量大，步驟多，周期長，而且制備探針及檢測中要用到放射性同位素，雖可利用非放射性同位素標記方法代替，但成本高，成功率低，因此影響了其推廣使用。mtDNA COⅠ基因為多拷貝，母系遺傳基因，既具有相對的保守性又有足夠的變異性，進化速率比核DNA快，很少存在插入和缺失，檢測靈敏度高，適用于種間鑒別(Hoelzel，1991;Hoy，1994)?；?COⅠ基因的DNA條形編碼技術(shù)盡管需要經(jīng)過產(chǎn)物回收、純化、測序以及序列比對等步驟，但目前已成為物種鑒定的新方法。SS-PCR技術(shù)由COⅠ標記技術(shù)轉(zhuǎn)化而來，具有重現(xiàn)性強、譜帶單一等優(yōu)點，適宜于大規(guī)?？焖贆z測分析。

本研究根據(jù)已知的美洲斑潛蠅mtDNA COⅠ基因序列，設(shè)計美洲斑潛蠅特異性引物1對，并通過SS-PCR技術(shù)證實該引物只對美洲斑潛蠅mtDNA具有擴增能力，對同域發(fā)生的其他種類的潛葉蠅類害蟲，如南美斑潛蠅、三葉斑潛蠅、蔥斑潛蠅、豌豆?jié)撊~蠅等沒有擴增能力;該技術(shù)體系不僅對美洲斑潛蠅的成蟲具有良好的擴增效果，而且對單頭1～3齡幼蟲、蛹以及單粒卵也具有同樣的擴增效果;同時，該技術(shù)體系還具有較強的靈敏性，其最低檢出閾值為1/3840頭成蟲;對靶標序列的測序及Gen-Bank比對結(jié)果顯示，該片段與美洲斑潛蠅的同源性為 100%(Shang et al.，2008;Yang et al.，2011)，而與其他雙翅目昆蟲的同源性均低于96%(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。此外，SS-PCR 分析技術(shù)操作簡便快捷，縮短了通關(guān)時間，提高了工作效率。因此，該技術(shù)體系可以用于美洲斑潛蠅的檢測鑒定工作，并在害蟲檢疫檢驗與檢測監(jiān)測中具有重要應(yīng)用價值。然而，由于我國菜田常見的潛葉蠅類害蟲種類較多，本研究中SS-PCR引物的特異性仍有待進一步驗證。

致謝:北京城市學(xué)院生物技術(shù)專業(yè)的袁波同學(xué)和長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物保護專業(yè)的陳婷婷同學(xué)協(xié)助完成部分試驗，特表感謝!

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