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    轉(zhuǎn)cry1Ac/cpti基因水稻對(duì)土壤氨氧化細(xì)菌群落組成和豐度的影響

    2012-10-12 08:14:00宋亞娜
    生物安全學(xué)報(bào) 2012年1期
    關(guān)鍵詞:轉(zhuǎn)基因稻田群落

    宋亞娜,蘇 軍,林 艷,王 鋒

    福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所,福建省農(nóng)業(yè)遺傳工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建福州350003

    土壤氮素生物地球化學(xué)循環(huán)是土壤物質(zhì)能量循環(huán)的重要組成部分,它能夠影響土壤質(zhì)量、氮素的植物吸收利用及農(nóng)田等生態(tài)系統(tǒng)的生產(chǎn)力、可持續(xù)性及環(huán)境變化。硝化作用是土壤氮素循環(huán)的重要環(huán)節(jié),對(duì)土壤氮素養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化具有重要意義。氨氧化細(xì)菌是執(zhí)行硝化作用第一步的關(guān)鍵微生物,即將氨氧化為亞硝酸鹽,該步驟也是硝化速率的限制性環(huán)節(jié)(Phillips et al.,2000)。雖然在水稻淹水時(shí)土壤處于厭氧條件而抑制硝化作用,但由于水稻根系能夠分泌O2,為水稻根表和根際提供了充足的氧,足以支持非專一性的好氧微生物過(guò)程,而使水稻根際具有顯著硝化作用的可能(Brune et al.,2000)。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),稻田土壤中不僅存在豐富的氨氧化微生物基因資源,而且其群落組成和豐度變化活躍。土壤類型、水稻品種、施肥及土壤pH等環(huán)境因素均可改變氨氧化細(xì)菌的群落組成或豐度(宋亞娜等,2009;鐘文輝等,2008;He et al.,2007;Nicol et al.,2008;Shen et al.,2008)。

    在轉(zhuǎn)基因水稻栽培中引入外源基因,有可能改變轉(zhuǎn)基因作物的根系分泌物、根系及植株殘?bào)w的組成及其降解過(guò)程,從而影響土壤物質(zhì)能量的遷移轉(zhuǎn)化過(guò)程,改變土壤微生物組成及土壤中礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的轉(zhuǎn)化循環(huán)(Masoero et al.,1999;Poerschmann et al.,2005、2008、2009;Saxena & Stotzky,2001)。目前,已有研究表明,轉(zhuǎn)Bt基因水稻秸稈的降解對(duì)土壤細(xì)菌和真菌群落沒有影響(Lu et al.,2010a、2010b;Wu et al.,2004)。但有關(guān)轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)與土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化密切相關(guān)的功能微生物(如氨氧化細(xì)菌)群落結(jié)構(gòu)的影響還未見報(bào)道。

    本研究通過(guò)3~4年的田間定位試驗(yàn)研究連續(xù)種植轉(zhuǎn)cry1Ac/cpti基因水稻后土壤氨氧化細(xì)菌群落組成和豐度的變化,旨在為評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因水稻種植的土壤生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    供試水稻是由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)遺傳工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研制的轉(zhuǎn)基因雜交稻Ⅱ優(yōu)科豐8號(hào)(GM)和非轉(zhuǎn)基因雜交稻Ⅱ優(yōu)明恢86(CK)。以三系水稻恢復(fù)系明恢86為受體,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將雙T-抗蟲PCDMARUBAC載體中的cry1Ac(蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白基因)和cpti(修飾的豇豆胰蛋白酶抑制劑基因)2個(gè)抗蟲基因?qū)胨荆@得能穩(wěn)定遺傳和表達(dá)的轉(zhuǎn)基因恢復(fù)系科豐8號(hào)。以科豐8號(hào)的T8代純合株系為父本、Ⅱ-32A為母本配制成轉(zhuǎn)基因雜交稻Ⅱ優(yōu)科豐8號(hào)。以轉(zhuǎn)基因水稻科豐8號(hào)的受體恢復(fù)系明恢86為父本、Ⅱ-32A為母本配制獲得非轉(zhuǎn)基因雜交稻Ⅱ優(yōu)明恢86。轉(zhuǎn)基因雜交稻Ⅱ優(yōu)科豐8號(hào)于2006年獲得農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因安全委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行生產(chǎn)性試驗(yàn)。

    1.2 定位試驗(yàn)

    2008年開始在具有防護(hù)措施的聯(lián)動(dòng)網(wǎng)室中建立水稻定位試驗(yàn)。地點(diǎn)位于福建省福州市郊的“吳鳳水稻試驗(yàn)基地”(26°01' 北緯、119°20'東經(jīng))。該試驗(yàn)基地屬暖濕亞熱帶季風(fēng)氣候,年無(wú)霜期長(zhǎng)達(dá)326 d,年均氣溫19.6℃,平均濕度77%,年均降水量1342.5 mm。供試土壤為砂壤,土壤有機(jī)質(zhì)含量為 23.32 g·kg-1,pH 6.15,全氮 1.65 g·kg-1,全磷(P2O5)0.76 g·kg-1,全鉀(K2O)18.28 g·kg-1,速效氮 154.53 mg·kg-1,速效磷 31.34 mg·kg-1,速效鉀 70.52 mg·kg-1。

    于2008、2009、2010和2011年連續(xù)4年種植轉(zhuǎn)cry1Ac/cpti基因抗蟲水稻。挑選飽滿的水稻種子于30℃催芽2 d,選發(fā)芽勢(shì)強(qiáng)、整齊一致的種子播種,1個(gè)月后插秧,株行距為20 cm×20 cm,單本插。4年均作中稻栽培,5月播種,6月插秧,10月收獲。前一年收獲后留茬10 cm割稻,稻茬留田自然越冬。次年春季將稻茬翻入土中,于6月繼續(xù)按前一年的小區(qū)排列方式種植。每種材料設(shè)3次重復(fù),6個(gè)小區(qū)隨機(jī)排列,每個(gè)小區(qū)種植水稻350株。定位試驗(yàn)期間除不使用殺蟲劑外,水肥和田間管理措施等均按當(dāng)?shù)爻R?guī)。

    1.3 樣品采集

    分別于2010(定位試驗(yàn)第3年)和2011年(定位試驗(yàn)第4年)水稻分蘗期(播種后60 d)、齊穗期(播種后90 d)及成熟期(播種后120 d)采集土壤樣品。采用五點(diǎn)取樣法,每次重復(fù)取5株水稻,將水稻整株挖起后取根系周圍分布密集的土層深度為10~20 cm的土壤,將5株水稻根系土壤混合為1個(gè)土樣,放入4℃冰盒中保存。于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)去除土樣根系、雜草和石塊等雜質(zhì)后混勻,分裝入50 mL塑料離心管中,-20℃保存以用于土壤微生物分析。

    1.4 分析方法

    1.4.1 土壤微生物總DNA提取 稱取0.5 g于-20℃保存的土壤樣品,采用FastDNA?SPIN Kit For Soil(Q BIOgene)試劑盒進(jìn)行土壤微生物總DNA的提取,將DNA樣品于-20℃冰箱保存待用。

    1.4.2 聚合酶鏈反應(yīng)—變性梯度凝膠電泳(PCRDGGE)分析 利用氨氧化細(xì)菌16S rRNA基因特異引物(Song et al.,2007)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增(表 1),檢測(cè)氨氧化細(xì)菌群落組成。反應(yīng)體系50 μL,其中,2 μL稀釋5倍的DNA模板加反應(yīng)液48 μL,反應(yīng)液包括1 μL Taq DNA 聚合酶(2.5 U· L-1,天根生物公司,北京),5 μL dNTPs(2 mmol·L-1各堿基,上海生物工程公司),5 μL 10×PCR-buffer(10倍 PCR緩沖液,天根生物公司,北京),前、后引物各4 μL(5 pmol· L-1,上海英駿生物工程公司)和 29 μL超純水。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳EB(溴化乙錠)染色檢查后,用40 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析,采用梯度為35%~50%的8%聚丙烯酰胺凝膠[化學(xué)變性劑為100%尿素7 mol·L-1和40%(v/v)去離子甲酰胺]在1倍TAE緩沖液中于150 V、60℃下電泳5 h。電泳后用10 mL SYBR green I(Sigma)(1倍 TAE稀釋10000倍)核酸染料染色45 min,然后用Bio-Rad成像系統(tǒng)拍照。

    表1 PCR擴(kuò)增引物及反應(yīng)條件Table 1 Primers and PCR conditions used for the study

    1.4.3 氨氧化細(xì)菌的豐度檢測(cè) 以土壤中氨氧化細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)表示氨氧化細(xì)菌豐度。利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)稻田土壤中氨氧化細(xì)菌16S rRNA基因數(shù)量。如表1所示,氨氧化細(xì)菌的熒光定量PCR擴(kuò)增采用16S rRNA基因特異引物,每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)。采用SYBR?Premix Ex TaqTM(TakaRa,大連)試劑盒于ABI PRISM7500 Real-Time PCR System擴(kuò)增儀上進(jìn)行絕對(duì)定量PCR分析。熒光定量 PCR反應(yīng)體系25 μL,其中,2 μL稀釋5倍的DNA模板加反應(yīng)液23 μL,反應(yīng)液包括12.5 μL SYBR?Premix Ex TaqTM(× 2),0.5 μL ROX Reference DyeⅡ (×50),前、后引物各 1 μL(5 pmol· L-1)和8 μL 超純水。

    1.4.4 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以非轉(zhuǎn)基因水稻土樣提取的DNA為模板進(jìn)行氨氧化細(xì)菌16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增(表1)。將100 μL PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳,切下含有目的基因的片段約 465 bp,用 E.Z.N.A.Gel Extraction Kit(OMEGA,美國(guó))膠回收試劑盒純化。按照試劑盒方法用pMD18-T載體連接PCR產(chǎn)物,以大腸桿菌DH5α制備的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物,在氨芐青霉素平板上進(jìn)行藍(lán)白斑試驗(yàn)篩選陽(yáng)性克隆。取部分陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌液送上海英駿生物工程有限公司測(cè)序,重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果經(jīng)GenBank Blast比對(duì),與氨氧化細(xì)菌16S rRNA基因(EU127347)同源性達(dá)99%。這表明重組質(zhì)??梢宰鳛榘毖趸?xì)菌進(jìn)行絕對(duì)熒光定量PCR分析的標(biāo)準(zhǔn)DNA。利用E.Z.N.A.Plasmid Mini Kit試劑盒提取重組質(zhì)粒DNA,然后用 Nanodrop(Gene Co.Ltd.,美國(guó))測(cè)定重組質(zhì)粒DNA 的質(zhì)量濃度,為99.0 ng·L-1。根據(jù)已知重組質(zhì)粒全序列和阿伏伽德羅常數(shù)[6.02×1023(分子數(shù))·moL-1]計(jì)算氨氧化細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù),為5.86 ×1010(cells)·μL-1。以 10 倍梯度稀釋氨氧化細(xì)菌16S rRNA基因重組質(zhì)粒以進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè),每個(gè)稀釋濃度重復(fù)3次,獲得氨氧化細(xì)菌16S rRNA基因標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.5 數(shù)據(jù)分析

    采用Quantity One(Bio-Rad)軟件對(duì)DGGE圖譜中DNA條帶的位置和亮度進(jìn)行數(shù)字化;利用CANOCO 4.0(Microcomputer Power,Ithaca,USA)軟件,根據(jù)不同處理DGGE結(jié)果的條帶亮度和位置的數(shù)字化數(shù)值,以不同水稻材料及其生育期為環(huán)境因素對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行冗余分析(redundancy discriminate analysis,RDA)(Marschner et al.,2002)。利用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 轉(zhuǎn)cry1Ac/cpti基因水稻對(duì)土壤氨氧化細(xì)菌群落組成的影響

    利用氨氧化細(xì)菌16S rRNA基因特異引物對(duì)稻田土壤氨氧化細(xì)菌群落組成進(jìn)行PCR-DGGE分析(圖1)。由DGGE圖譜可見,無(wú)論在定位試驗(yàn)第3年(圖1A)還是第4年(圖1B),稻田土壤中都存在豐富的氨氧化細(xì)菌基因,各個(gè)樣品均呈現(xiàn)較多的DGGE條帶。不同DGGE條帶代表土壤中不同種類的氨氧化細(xì)菌,條帶亮度表示在本研究的PCR試驗(yàn)條件下各類氨氧化細(xì)菌的相對(duì)豐度。

    依據(jù)DGGE圖譜的條帶位置和亮度的數(shù)字化數(shù)值計(jì)算氨氧化細(xì)菌群落多樣性指數(shù)(Shannonwiener index),結(jié)果如表2所示。在定位試驗(yàn)第3、4年,水稻各生育期內(nèi)GM和CK的氨氧化細(xì)菌群落多樣性指數(shù)均沒有顯著差異。這表明種植轉(zhuǎn)cry1Ac/cpti基因水稻不會(huì)改變稻田土壤氨氧化細(xì)菌群落多樣性。另外,同一種水稻的氨氧化細(xì)菌群落多樣性指數(shù)在水稻不同生育期間的差異也不顯著。

    由圖2可見,在定位試驗(yàn)第3、4年,變異較大的x軸方向上的氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布差異主要表現(xiàn)在不同水稻生育期間,而同一生育期內(nèi)不同水稻材料的氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布較為接近。同時(shí),經(jīng)RDA顯著性相關(guān)分析也顯示,這2年的土壤氨氧化細(xì)菌群落組成的變化只與水稻生育期存在顯著相關(guān)性,顯著性水平分別為0.002和0.018。這表明稻田土壤氨氧化細(xì)菌群落組成隨水稻生長(zhǎng)而發(fā)生變化,但種植轉(zhuǎn)cry1Ac/cpti基因水稻對(duì)土壤氨氧化細(xì)菌群落組成沒有明顯影響。

    圖1 定位試驗(yàn)第3年(A)和第4年(B)稻田土壤氨氧化細(xì)菌群落組成的DGGE圖譜Fig.1 DGGE images of community composition of ammoniaoxidizing bacteria in paddy field in the third(A)and fourth(B)year after establishment of the experimental field site

    2.2 轉(zhuǎn)cry1Ac/cpti基因水稻對(duì)土壤氨氧化細(xì)菌群落豐度的影響

    利用氨氧化細(xì)菌16S rRNA基因的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)DNA建立了絕對(duì)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖 3)。其中,標(biāo)準(zhǔn)曲線的 R2為 0.99,斜率為 3.05,線性范圍達(dá)到5個(gè)數(shù)量級(jí),為5.86×103~5.86×107(cells)·μL-1。

    依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,用熒光定量PCR檢測(cè)到不同處理的土壤氨氧化細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)為1.66 ×106~1.85 ×107(copies)·g-1(干土)。在定位試驗(yàn)第3、4年,土壤氨氧化細(xì)菌的豐度在水稻生長(zhǎng)前期均隨水稻生長(zhǎng)而增大,至水稻齊穗期時(shí)達(dá)到最大,之后逐漸減小(圖4),GM和CK的氨氧化細(xì)菌豐度在齊穗期時(shí)均顯著高于分蘗期(P<0.05);但在水稻生長(zhǎng)過(guò)程中,氨氧化細(xì)菌豐度在GM和CK處理間的差異均未達(dá)到顯著性水平(P>0.05)。由此可見,稻田土壤氨氧化細(xì)菌豐度受水稻生育期的影響較大,而轉(zhuǎn)cry1Ac/cpti基因水稻對(duì)土壤氨氧化細(xì)菌豐度沒有明顯影響。

    表2 定位試驗(yàn)第3、4年稻田土壤氨氧化細(xì)菌群落的多樣性指數(shù)Table 2 The diversity of the ammonia-oxidizing bacterial community,characterised by the Shannon index of diversity,in the third and fourth year after establishment of the experimental field site

    圖2 定位試驗(yàn)第3年(A)和第4年(B)稻田土壤氨氧化細(xì)菌群落組成的冗余分析Fig.2 RDA of the community composition of ammonia-oxidizing bacteria in paddy field in the third(A)and fourth(B)year after establishment of the experimental field site

    圖3 氨氧化細(xì)菌16S rRNA基因絕對(duì)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of real-time PCR of 16S rRNA gene of ammonia-oxidizing bacteria

    圖4 定位試驗(yàn)第3年(A)和第4年(B)稻田土壤氨氧化細(xì)菌的豐度Fig.4 Abundance of ammonia-oxidizing bacteria in paddy field in the third(A)and fourth(B)year after establishment of the experimental field site

    3 討論

    目前,關(guān)于轉(zhuǎn)基因作物對(duì)環(huán)境微生物影響的研究結(jié)果因作物種類、目標(biāo)基因、微生物種類等不同而存在差異。在對(duì)轉(zhuǎn)抗病基因木瓜的研究中發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因品種的種植能夠改變土壤真菌或細(xì)菌的群落組成(Wei et al.,2006)。而利用磷脂脂肪酸分析方法研究表明,土壤微生物群落結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米間沒有顯著差異(Griffiths et al.,2005)。轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲水稻的秸稈或根系還田對(duì)土壤細(xì)菌或真菌的群落組成也沒有明顯影響(Lu et al.,2010a、2010b)。轉(zhuǎn) Bt基因作物對(duì)土壤微生物沒有影響可能是由于Bt蛋白在土壤中可快 速 降 解 (Daudu et al.,2009;Wang et al.,2006)。

    現(xiàn)有的關(guān)于轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲水稻對(duì)環(huán)境微生物群落影響的研究多集中于土壤總微生物如細(xì)菌或真菌的群落方面,而對(duì)一些與土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化更為密切相關(guān)的功能微生物的研究較少。本研究通過(guò)田間定位試驗(yàn)分析了轉(zhuǎn)cry1Ac/cpti基因雜交稻Ⅱ優(yōu)科豐8號(hào)連續(xù)種植第3、4年,對(duì)與土壤氮素轉(zhuǎn)換密切相關(guān)的氨氧化細(xì)菌群落組成和豐度的影響。結(jié)果表明,土壤氨氧化細(xì)菌的群落組成和豐度均只與水稻的生長(zhǎng)發(fā)育期相關(guān),而在轉(zhuǎn)cry1Ac/cpti基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻間沒有顯著差異??梢?,田間種植轉(zhuǎn)cry1Ac/cpti基因水稻對(duì)土壤氨氧化細(xì)菌多樣性沒有明顯影響。

    同時(shí),本研究采用了PCR-DGGE和熒光定量PCR分子生物學(xué)方法。由于土壤中大部分微生物是不可培養(yǎng)的,用常規(guī)的培養(yǎng)方法研究土壤微生物群落的局限性很大。而以 DNA為基礎(chǔ)的PCRDGGE方法能夠較全面地反映土壤微生物組成,熒光定量PCR方法更可準(zhǔn)確檢測(cè)土壤微生物的豐度。另外,本研究通過(guò)連續(xù)4年的田間定位試驗(yàn),所得結(jié)果能更好地反映種植轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)土壤微生物的影響。本研究證明,在一定時(shí)期內(nèi)種植轉(zhuǎn)cry1Ac/cpti抗蟲基因水稻不會(huì)產(chǎn)生影響土壤氨氧化細(xì)菌群落組成和豐度的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。

    此外,由于土壤中微生物種類繁多、數(shù)量龐大等多樣性特征有利于保證其群落的相對(duì)穩(wěn)定,使得轉(zhuǎn)基因作物種植對(duì)土壤微生物多樣性的干擾可能在一定時(shí)期內(nèi)不會(huì)表現(xiàn)。因此仍需要通過(guò)長(zhǎng)期定位試驗(yàn)進(jìn)一步監(jiān)測(cè)種植轉(zhuǎn)cry1Ac/cpti基因水稻對(duì)土壤各類微生物多樣性及其生態(tài)功能的影響,從而綜合評(píng)價(jià)種植抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)稻田土壤生態(tài)系統(tǒng)的安全性。

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