酶解法提取海南龍血樹葉總皂苷的工藝研究

楊 力，賈桂云

（海南師范大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，海南 ?？?571158）

海南龍血樹（Dracaena cambodiana pierre ex Gagnep）又名小花龍血樹，龍舌蘭科（Agavaceae），龍血樹屬（Dracaena）.分布于海南省西南部，國家二級保護瀕危種.海南龍血樹葉中含有甾體皂苷[1].甾體皂苷主要分布菝契科、玄參科、薯蕷科、百合科、龍舌蘭科等單子葉植物中，甾體皂苷有極高的藥用價值,具有有抗菌、抗炎、抗真菌、抗細胞毒性等作用，臨床用于心腦血管疾病的防治；皂苷經(jīng)體外試驗顯示具有較強的抑制ADP誘導(dǎo)的家兔血小板聚集作用[2-4].

根據(jù)甾體皂苷在無水條件下，遇某些酸類可產(chǎn)生與三萜皂苷相類似的顏色反應(yīng)，故用五環(huán)三萜類的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)對照品，選用顯色靈敏的香草醛-高氯酸反應(yīng)進行顯色[5].

本研究采用酶解-乙醇浸提法[6]提取海南龍血樹葉的總皂苷，為海南龍血樹葉的皂苷的提取及藥用研究提供依據(jù).

1 儀器、材料與試劑

1.1 儀器

TU-1901雙光束紫外分光光度計（北京普系通用儀器有限責(zé)任公司）；722紫外分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）；FZ-102型微型植物試樣粉碎機（上海新諾儀器設(shè)備有限公司）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SB-5200DTD超聲波清洗機（深圳富嘉達超聲波設(shè)備）；TP-214電子天平（上海升隆電子科技有限公司）；

1.2 材料

海南龍血樹葉采摘于海南師范大學(xué)桂林洋校區(qū)化學(xué)樓庭院內(nèi)，洗凈、陰干，剪成小片，40℃干燥后粉碎，做供試樣品.

1.3 試劑

熊果酸對照品（含量≥98%上海順勃生物工程有限公司），纖維素酶（北京奧科鼎盛生物科技有限公司），冰乙酸、無水乙醇、95%乙醇、香草醛、高氯酸等均為國產(chǎn)分析純試劑.

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 海南龍血樹葉總皂苷含量的測定方法

2.1.1 對照品溶液的制備

精密稱取在105℃干燥至恒重的熊果酸對照品10.0 mg，用無水乙醇溶解、定容50 mL，配制成質(zhì)量濃度200 μg/mL的熊果酸對照品溶液.

2.1.2 樣品溶液的制備

精密稱取海南龍血樹葉粉1.0020 g至50 mL圓底燒瓶中，按料液比1∶10加水，調(diào)節(jié)pH=5.0，加入纖維素酶.使水解液中酶質(zhì)量濃度為0.15 mg/mL，50℃水浴酶解2 h.然后80℃水浴滅活30 min，離心分離，沉淀轉(zhuǎn)移到圓底燒瓶中，加入95%乙醇10 mL，在70℃下浸提1 h.將提取液與酶解液合并，抽濾.濾液65℃減壓蒸干，用無水乙醇溶解并定容100 mL.

2.1.3 最大吸收波長的確定

分別吸取0.2 mL熊果酸對照品溶液和樣品溶液于兩支具塞試管中，80℃水浴揮干溶劑，加入0.2 mL新配制的5%的香草醛-冰乙酸，0.8 mL高氯酸溶液，在70℃水浴加熱15 min，使其反應(yīng)完全，取出流水冷卻10 min，加入4 mL冰乙酸，搖勻.隨行試劑作空白，在450～600 nm波長范圍內(nèi)進行波譜掃描，熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液在545 nm出現(xiàn)最大吸收，故確定545 nm為最大吸收波長.

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取熊果酸對照品溶液0.0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 mL置于具塞試管中，按3.1.3項下方法，在545 nm測吸光度.以吸光度為縱坐標(biāo)，熊果酸的加入量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖1）.

回歸方程y=-0.0198+0.0101x，r=0.9993.方程在0～140 μg范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系.

2.1.5 總皂苷含量的測定

準(zhǔn)確吸取0.1 mL樣品溶液于具塞試管中，按2.1.3項下方法測定.計算出海南龍血樹葉總皂苷濃度及其總皂苷提取率.

圖1 熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of oleanolic acid

式中：C為樣品溶液的總皂苷濃度（μg/mL）；V為樣品溶液的總體積（mL）；W為所用龍血樹葉粉的質(zhì)量（μg）.

2.2 方法考查

2.2.1 顯色液穩(wěn)定性試驗

準(zhǔn)確吸取0.1 mL樣品溶液，按2.1.3項下方法，每隔10 min測一次吸光度，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差.結(jié)果見表1.

表1 穩(wěn)定性試驗Tab.1 Stability test

結(jié)果表明，顯色時間在60 min內(nèi)吸光度是穩(wěn)定的，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=0.41%（n=6）.因此在本實驗測定時間范圍內(nèi)，皂苷和顯色劑生成的有色化合物是穩(wěn)定的.

2.2.2 精密度試驗

準(zhǔn)確吸取熊果酸對照品溶液6份，每份0.2 mL，按2.1項下的方法，測樣品溶液吸光度，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差.結(jié)果見表2.

計算RSD=1.57%（n=6），表明精密度良好.

2.2.3 加樣回收率試驗

分別吸取0.05，0.1，0.15，0.20，0.25 mL已知濃度的樣品溶液，再加入0.1 mL熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.1項下方法測定，計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差.結(jié)果見表3.

RSD=1.02%（n=5），平均回收率為100.40%，結(jié)果表明，本實驗方法具有良好的回收率.

表2 精密度試驗Tab.2 Precision test

表3 加樣回收率試驗Tab.3 Recovery test

2.3 海南龍血樹葉總皂苷的提取工藝研究

采用酶解法,通過單因素試驗和正交試驗，考查酶質(zhì)量濃度、酶解溫度、pH值、酶解時間、料液比等因素對提取率的影響.

2.3.1 酶質(zhì)量濃度對提取率的影響

精密稱取海南龍血樹粉5份，每份1.00 g，在pH=4.0，料液比為1∶10，酶解溫度為50 ℃，酶質(zhì)量濃度分別為 0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.15 mg/mL、0.2 mg/mL、0.25 mg/mL，水浴酶解1 h.結(jié)果見圖2.

圖2 酶質(zhì)量濃度對提取率的影響Fig.2 Effects of concentration of cellulase

結(jié)果表明，隨著酶質(zhì)量濃度的增大，皂苷的提取率增大，在0.15 mg/mL時皂苷提取率達到最大，但隨著酶質(zhì)量濃度的繼續(xù)增大，皂苷的提取率開始顯著下降.

2.3.2 酶解溫度對提取率的影響

精密稱取海南龍血樹粉5份，每份1.00 g，料液比為1∶10，pH=4.0，酶質(zhì)量濃度為0.15 mg/mL，酶解時間1 h，分別在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃中水浴酶解.結(jié)果見圖3.

圖3 酶解溫度對提取率的影響Fig.3 Effects of temperature of enzymatic hydrolysis on extraction rate

結(jié)果表明，總皂苷的提取率隨著酶解溫度的升高而升高，在50℃時總皂苷的提取率達到最大.繼續(xù)升高酶解溫度，總皂苷的提取率開始下降.因此，最佳酶解溫度為50℃.

2.3.3 pH對提取率的影響

精密稱取海南龍血樹葉粉5份，每份1.00 g，在酶質(zhì)量濃度為0.15 mg/mL，料液比為1∶10，酶解溫度50 ℃，酶解時間為1 h，pH值分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，水浴酶解.結(jié)果見圖4.

圖4 pH對提取率的影響Fig.4 Effects of pH on extraction rate

結(jié)果表明，在pH=5.0時皂苷的提取率達到最大，在pH大于5.0，皂苷的提取率略有下降，故最佳pH值為5.0.

2.3.4 酶解時間對提取率的影響

精密稱取海南龍血樹葉粉5份，每份1.00 g，在pH=5.0，料液比1∶10，酶濃度為0.15 mg/mL，酶解溫度50 ℃，酶解時間分別為0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h，水浴酶解.結(jié)果見圖5.

圖5 酶解時間對提取率的影響Fig.5 Effects of extracting time on extraction rate

結(jié)果表明，隨著酶解時間的延長，總皂苷的提取率增大，酶解時間2.0 h提取率最高，而后增加緩慢，選擇最佳酶解時間為2.0 h.

2.3.5 料液比對提取率的影響

精密稱取海南龍血樹葉粉5份，每份1.00 g，在pH=5.0，酶濃度為0.15 mg/mL，溫度50℃，酶解時間為1.5 h，料液比分別為1∶5、1∶8、1∶10、1∶12、1∶15，水浴酶解.

結(jié)果表明，料液比1∶12時提取率最高，繼續(xù)增加料液比，提取率變化趨于平緩.

2.3.6 正交試驗優(yōu)化工藝參數(shù)

為研究單因素對總皂苷提取率影響程度和交互作用，考查酶質(zhì)量濃度、酶解溫度、酶解液PH、酶解時間、料液比等5個因素，每個因素3個水平，采用L9（35）正交試驗，確定最佳提取工藝.因素和水平見表4，試驗結(jié)果見表5.

表4 因素水平表Tab.4 Actors and levels

結(jié)果表明，影響海南龍血樹葉總皂苷提取率的因素中，影響程度為：C＞A＞B＞E＞D，即pH值＞酶質(zhì)量濃度＞酶解溫度＞料液比＞酶解時間.最佳提取工藝是A3B2C2D1E2，即酶質(zhì)量濃度0.20 mg/mL，酶解溫度50℃，pH=5.0，酶解時間為1.5 h，料液比分別為1∶12，為最佳提取工藝.在此條件下做驗證試驗，海南龍血樹葉總皂苷的提取率最高為4.13%.

表5 正交試驗結(jié)果Tab.5 Results of orthogonal test

3 結(jié)論

海南龍血樹葉粉用纖維素酶進行酶解，減少了纖維素對皂苷提取的影響.用乙醇浸提，產(chǎn)物用紫外分光光度計進行比色分析，操作簡便，顯色靈敏度高，而且重現(xiàn)性較好.

海南龍血樹葉的化學(xué)成分較復(fù)雜，目前尚沒有關(guān)于海南龍血樹葉成分的報道.本研究采用單因素及正交試驗，篩選出了海南龍血樹葉總皂苷的最佳提取工藝條件，為進一步研究開發(fā)海南龍血樹葉的藥用價值提供了依據(jù).

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