不同抗凝劑和激活劑組合在自體富血小板血漿凝膠支架促進脂肪干細胞增殖的影響

張 寧，李 放，羅 濤

1北京軍區(qū)總醫(yī)院 骨科，北京 100700；2解放軍總醫(yī)院/軍醫(yī)進修學院，北京 100853

富血小板血漿(platelet rich plasma，PRP)是全血經濃集后分離得到的血液制品[1-2]。通常認為血小板濃度達到全血的4倍即可稱為富血小板血漿。其富含高濃度促進骨組織和軟組織再生修復的生長 因 子 TGF-β1、TGF-β2、EGF、FGF、PDGF、VEGF、IL-1[3-5]。而富血小板血漿最大優(yōu)勢在于其來源于患者自身，無免疫原性，使其在組織工程應用中有顯著優(yōu)勢。應用富血小板血漿PRP復合脂肪干細胞(adipose derived stromal cells，ADSCs)支架材料，構建組織工程髓核，治療椎間盤退變性疾病的臨床應用提供方法。目前國內外抗凝劑和激活劑選擇尚無統(tǒng)一標準。本實驗在制作自體PRP支架并植入ADSCs過程中，使用不同抗凝劑(肝素、EDTA)和激活劑(凝血酶、Ⅰ型膠原)，探討各組之間ADSCs生長情況的差異性，為體內試驗打下基礎。

材料和方法

1 實驗動物及分組 取3月齡新西蘭雄性大白兔10只，體質量2.0-2.5kg，由軍事醫(yī)學科學院動物中心提供。在制作自體PRP支架并植入ADSCs過程中，每1.0ml L-DMEM完全培養(yǎng)基中含使用不同抗凝劑(肝素、EDTA)和激活劑(牛凝血酶、Ⅰ型膠原)PRP，EDTA與凝血酶組，EDTA與Ⅰ型膠原組，肝素與凝血酶組，肝素與Ⅰ型膠原組，空白對照組，L-DMEM完全培養(yǎng)基中不含PRP。

2 脂肪干細胞培養(yǎng)與鑒定 將成年新西蘭大白兔以3.0%戊巴比妥鈉(1.0ml/kg)耳緣靜脈麻醉，取兔肩胛間區(qū)皮下脂肪。參照馬健[6]等文獻的方法進行脂肪干細胞分離培養(yǎng)和鑒定，取第3代脂肪干細胞進行實驗。

3 富血小板血漿制備 用注射器從兔耳中央動脈抽血分別取5ml移入兩組抗凝管(EDTA抗凝管和肝素抗凝管)中。采用二次離心法先以2 400r/min，離心10min，超凈臺內用槍頭吸取全部上清液以及白膜層，加入離心管中，再次以3 600r/min離心15min，，棄掉約3/4上清液，剩余液體即為PRP，約0.5ml[6]。制備PRP凝膠前需分別于兩組激活劑混和。以10ml PRP加入牛凝血酶(Sigma，USA)60U和1ml 10% CaCl的比例混合。I型膠原(Sigma，USA)20μg/ml，并用碳酸氫鈉緩沖至pH 7.4[7]。

4 脂肪干細胞生長增殖能力測定 取第3代脂肪干細胞按1 000個/孔接種到7塊96孔板內，用不含血清的L-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h使其同步化后，棄去培養(yǎng)液及未貼壁細胞，將每塊板上的孔隨機分為5組，每組6孔(共用30個孔)，根據(jù)不同分組分別加入相應L-DMEM培養(yǎng)基，分別37.8℃培養(yǎng)7d，每天計數(shù)1塊板，連續(xù)觀察7d，繪制細胞生長曲線。用MTT法在第2、3、4、6天檢測細胞存活和增殖能力。在每孔內加入5mg/ml MTT液50μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去MTT液，每孔加入150μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩5min，用酶聯(lián)免疫檢測儀法測定吸光度A值(490nm)，每個樣品均重復測量6次，取平均值。

5 各組TGF-β1，Ⅱ膠原及sox-9含量測量 1)TGF-β1的測量：通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)定量檢測TGF-β1的含量。具體操作遵循操作手冊。所有OD值都減除零孔值后再行計算；以標準品 1 000、500、250、62.5、31、15.6、0ng/ml之OD值在雙對數(shù)紙上作圖，畫出標準曲線。通過標本OD值在標準曲線上查出相對應TGF-β1的濃度。2)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)定量檢測細胞的Ⅱ膠原：取第3代脂肪干細胞按2×104個/孔的濃度在96孔培養(yǎng)板內培養(yǎng)過夜，用不含血清的L-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h使其同步化后棄去培養(yǎng)液及未貼壁細胞，將每塊板上的孔隨機分為5組，每組6孔(共用30個孔)，根據(jù)不同分組加入含不同抗凝劑和激活劑PRP的L-DMEM培養(yǎng)液，3d后PBS清洗，體積分數(shù)2%甲醛固定，體積分數(shù)0.3%過氧化氫中和內源性過氧化物酶，加入Ⅱ膠原抗體，室溫下孵育60min，加入過氧化物酶標記的二抗30min后，用0.25mol/L的硫酸中止反應，每孔100μl的樣品轉移至96孔培養(yǎng)板內，使用酶標儀在吸光度450nm(A450nm)條件下測量膠原的產生。通過realtime RT-PCR測量sox-9基因含量，把脂肪干細胞加入向軟骨分化培養(yǎng)液(Cambrex公司)中培養(yǎng)21d并在前7天加入PRP。實時定量RT-PCR是使用ABI PRISM7900檢測系統(tǒng)。用Trizol試劑提取總RNA，逆轉錄合成cDNA。cDNA樣本用于PCR分析[8]。使用相對標準化曲線法進行量化和規(guī)范化的內部控制。

6 統(tǒng)計學分析 使用SPSS16.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)用-x±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 血小板計數(shù) 全血為(181.75±41.44)×109/L，使用EDTA抗凝管PRP中含的血小板含量(1 040.01±159.72)×109/L約為全血的5.7倍。使用肝素抗凝管PRP中含的血小板含量(795.01±140.69)×109/L約為全血的4.2倍。

2 ADSCs生長曲線及增殖情況 各組脂肪干細胞均有增長且隨著時間點增長。在培養(yǎng)第2天各組細胞數(shù)無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，可能與細胞處于G0靜止期有關，在第3-7天，各組細胞數(shù)有明顯增長，并且加入PRP的各組與空白對照組相比明顯升高(P<0.05)，表明細胞處于快速生長期。但第3天PRP各組間差異不明顯(P>0.05)，在第4-7天EDTA-凝血酶組與其他各組相比細胞數(shù)明顯較高(圖1)。MTT法也顯示各組PRP細胞數(shù)與空白對照組相比均有增加，在培養(yǎng)第6天，EDTA-凝血酶組細胞數(shù)較空白對照組升高約2.5倍。見表1。

3 各組TGF-β1、Ⅱ膠原及sox-9含量 在基因表達方面，我們發(fā)現(xiàn)軟骨分化標志物sox-9增長更加明顯(最高約為8倍)，而TGF-β1(最高約為5.8倍)，Ⅱ型膠原(最高約為1.8倍)。各PRP組sox-9的基因相對于管家基因18s表達量分別為30.11±4.03，25.78±5.24，26.53±6.05，22.77±4.33，空白對照組為3.75±0.21(P<0.01)。TGF-β1表達量分別為289.83±24.36，203.4±33.11，205.71±48.54，198.71±19.01，空白對照組為50.71±10.17 (P<0.05)。Ⅱ型膠原表達量分別為0.54±0.04，0.48±0.03，0.48±0.02，0.46±0.03，空白對照組為0.30±0.02(P<0.05)。見圖2。

表1 MTT法測定各組脂肪干細胞增殖能力Tab 1 Proliferation of ADSC in different groups detected by MTT assay(-x±s, %)

圖1 各組別脂肪干細胞生長曲線圖Fig 1 Growth curves of bone ADSC in different groups

討 論

富血小板血漿中含高濃度的生長因子，可促進細胞生長及組織修復。研究顯示富血小板血漿可促進干細胞增殖并誘導其向成骨、軟骨及脂肪細胞等多個方面轉化，也可刺激軟組織再生，并促進傷口早期愈合。富血小板血漿凝膠是三維的多孔結構，具有一定的黏附性，這有利于脂肪干細胞黏附生長、防止生長因子流失，并能保持局部較高的生長因子濃度[9]。本文使用的脂肪間充質干細胞作為實驗種子細胞有以下優(yōu)勢：首先取材簡便，成本低廉；其次與骨髓干細胞相比，其在生長動力學、細胞老化、基因轉染和細胞的黏附特性等方面無明顯差別。目前已證實脂肪干細胞在一定條件下能夠向中胚層細胞系包括脂肪、軟骨、骨、肌肉和其他胚層細胞系包括神經、內皮等轉化。

PRP再生潛力是基于血小板破裂時生長因子的釋放，因此制作PRP時要求使用的抗凝劑盡量減少對血小板的損傷，保持血小板的生理活性。陳小玲等[10]報道了不同濃度凝血酶對富血小板血漿促骨髓基質的影響，研究顯示在使用凝血酶時，20、40、60U/ml促增殖作用呈濃度依賴關系，且60U/ml組作用明顯高于其他各組。鄧新立等[11]報道了不同濃度血小板激活劑激活血小板微粒膜表達PAC-1、CD62p的比較，結果顯示隨著激活劑濃度的增加，CD62p+PMP、PAC-1+PMP的百分率都在逐漸增加。目前國內外對抗凝劑和促凝激活劑并無統(tǒng)一標準。本實驗研究的目的是找出最佳的抗凝劑和激活劑組合。通過本實驗可以得出結論：EDTA與凝血酶組別自體富血小板血漿(PRP)對促進脂肪干細胞增殖效果最好，是最佳的抗凝劑和激活劑組合。

綜上所述，本研究將抗凝劑和激活劑兩種變量進行聯(lián)合研究，更好地探索多變量情況下PRP對細胞培養(yǎng)的影響以及自身釋放生長因子的影響，也彌補了以往實驗中只對單一變量的研究，忽略了試劑間的協(xié)同效應或拮抗效應，通過本實驗論證，為下一步體內試驗試劑的選擇提供了依據(jù)。本實驗不足之處在于抗凝劑和促凝劑的種類太少，對實驗人員操作要求高，但限于實驗條件以及工作量，有可能忽略了其他更好的試劑。由于本實驗是動物體外實驗，實驗結果是否與人類相似，或者有可能相反，需進一步研究。

圖 2 各組別TGF-β1、Ⅱ膠原量和sox-9基因的表達量Fig 2 Expression of markers of TGF-β1, col1gen-2 and sox-9 1: EDTA and thrombin; 2: EDTA and collagenⅠ; 3: Heparin and thrombin; 4: Heparin and collagenⅠ; 5: Control group

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