內(nèi)熱針對(duì)大鼠軟組織慢性損傷的影響

張文玉，高 謙，王 剛，王 飛，楊志麗

解放軍總醫(yī)院 康復(fù)醫(yī)學(xué)科，北京 100853

慢性軟組織損傷在臨床上很常見，損傷后功能恢復(fù)一直是康復(fù)治療的重點(diǎn)，因此要篩選出有效的治療方案。軟組織內(nèi)熱針(簡(jiǎn)稱內(nèi)熱針)采用針芯電阻絲均勻加熱，針身溫度隨加熱時(shí)間波動(dòng)小，針尖溫度容易控制[1]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察內(nèi)熱針療法對(duì)大鼠腓腸肌肌肉肌腱接頭處慢性損傷后形態(tài)學(xué)變化和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)的水平變化探討內(nèi)熱針的治療機(jī)制。

材料和方法

1 動(dòng)物 清潔級(jí)Wistar大鼠(解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)27只，雄性，體質(zhì)量200-350g。分籠飼養(yǎng)，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)同體混合飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

2 儀器和試劑 軟組織打擊器自制。軟組織內(nèi)熱治療儀由南京理工大學(xué)研制，內(nèi)熱針針體長(zhǎng)度為13cm，直徑1.0mm，針柄長(zhǎng)4cm，直徑2.2mm，針尾為直徑3mm的二相電源插頭。BDNF試劑盒購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

3 慢性軟組織損傷動(dòng)物模型制作 參考Kami等機(jī)械沖擊挫傷造模方法[2]，將大鼠稱重編號(hào)，用10%水合氯醛以3ml/kg腹腔內(nèi)注射，麻醉后俯臥位固定于鼠板上，大鼠后腿處理方法和軟組織打擊器對(duì)其砸傷方法參照參考文獻(xiàn)[3]，雙側(cè)腓腸肌肌肉肌腱接頭處進(jìn)行慢性損傷造模。造模后不做任何處理，正常環(huán)境下常規(guī)飼養(yǎng)，15d后根據(jù)大鼠的行為步態(tài)觀察和病理組織切片提示，形成慢性軟組織損傷動(dòng)物模型。標(biāo)準(zhǔn)見參考文獻(xiàn)[4]。

4 動(dòng)物分組和實(shí)驗(yàn)治療 將27只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組3只，損傷對(duì)照組12只、內(nèi)熱針組12只，內(nèi)熱針組又分為治療3、7、14、28d四個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各3只，損傷對(duì)照組按以上時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)分組，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3只。每只大鼠取雙側(cè)后腿損傷組織，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)標(biāo)本為6個(gè)。正常對(duì)照組：常規(guī)飼養(yǎng)，不做任何處理。損傷對(duì)照組：造模成功后不予任何治療，自然恢復(fù)。內(nèi)熱針組：將大鼠麻醉后固定于鼠板，雙下肢穿刺部位常規(guī)消毒，用13cm的內(nèi)熱針從跟腱處距離腓腸肌0.5cm的位置，與腓腸肌平行方向刺入組織內(nèi)3cm，針尾連接電源，加熱溫度設(shè)為43℃，加熱20min[1,4]。

5 采樣及指標(biāo)測(cè)定 各時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，逐層切開皮膚筋膜，取出腓腸肌肌肉肌腱接頭處，用4%中性緩沖多聚甲醛固定標(biāo)本24h，常規(guī)脫水，石蠟包埋、切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，觀察組織在鏡下形態(tài)學(xué)變化。免疫組化檢測(cè)：標(biāo)本處理制成石蠟切片同上，免疫組化實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。陽(yáng)性為出現(xiàn)棕黃色顆粒，在光鏡下(200倍)采集圖片，對(duì)圖片分析采用Image-Pro Plus圖片分析軟件測(cè)定各組織標(biāo)本中陽(yáng)性個(gè)數(shù)。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料-x±s表示，采用單因素分析、t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠腓腸肌肌肉肌腱接頭處的光鏡形態(tài)改變正常肌纖維呈長(zhǎng)柱形，細(xì)絲狀，沿肌肉長(zhǎng)軸平行排列，肌腱排列致密，條紋清晰，與周圍組織分界清楚；治療3d時(shí)，內(nèi)熱針組和損傷對(duì)照組基本相似，肌纖維扭曲和肌漿疏松，偶見個(gè)別肌纖維呈小節(jié)段變性壞死，局部出現(xiàn)斷裂，間質(zhì)纖維組織增生伴淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，可見少許出血，肌腱排列紊亂，間隙變大，部分?jǐn)嗔?；治?、14d時(shí)，損傷對(duì)照組肌纖維出現(xiàn)萎縮，部分嗜堿性增強(qiáng)，間質(zhì)纖維增生，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肌腱結(jié)構(gòu)紊亂；內(nèi)熱針組為部分肌纖維胞體嗜堿性增強(qiáng)、間質(zhì)纖維輕度增生伴大量淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞浸潤(rùn)，可見新生毛細(xì)血管形成，橫向吻合枝增多，部分胞體形態(tài)較正常，肌腱排列稍紊亂，部分炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；治療28d時(shí)，損傷對(duì)照組肌纖維局灶萎縮，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)增生，形成瘢痕樣組織；內(nèi)熱針組肌纖維形態(tài)逐步恢復(fù)正常，排列規(guī)整，局部炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肌腱排列致密，條紋較前清晰，大部分結(jié)構(gòu)與正常形態(tài)相似(見圖1)。

2 三組BDNF比較 正常對(duì)照組BDNF 8.5±1.8，損傷對(duì)照組和內(nèi)熱針組各時(shí)間點(diǎn)BDNF活性均高于正常對(duì)照組(P<0.05)，治療3d，內(nèi)熱針治療組與損傷對(duì)照組BDNF比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，7、14d內(nèi)熱針組顯著高于損傷對(duì)照組(P<0.05)，28d內(nèi)熱針組低于損傷對(duì)照組(P<0.05)，見表1。

圖1 內(nèi)熱針組大鼠腓腸肌肌肉肌腱接頭處組織HE光鏡下形態(tài)學(xué)變化(×100)A：正常組肌肉肌腱接頭處結(jié)構(gòu)；B：內(nèi)熱針組治療3d肌肉肌腱接頭處；C：內(nèi)熱針組治療14d肌肉組織；D：內(nèi)熱針組治療14d肌腱組織；E：內(nèi)熱針組治療28d后肌肉肌腱接頭處Fig 1 Morphology of gastrocnemius muscle tendon in interior heat needle therapy group under optical microscope with HE staining A: normal junction of gastrocnemius muscle tendon; B:junction of gastrocnemius muscle tendon in interior heat needle therapy group 3d after treatment; C: muscle tissue in interior heat needle therapy group 14d after treatment;D: tendon tissue in interior heat needle therapy group 14d after treatment; E: junction of gastrocnemius mucle tendon interior heat needle therapy group 28d after treatment

表1 損傷對(duì)照組與內(nèi)熱針組不同時(shí)間點(diǎn)腓腸肌肌肉肌腱接頭處BDNF表達(dá)量比較Tab 1 Expression of BDNF in junction of gastrocnemius muscle tendon at different time points between injury control group and interior heat needle therapy group(-x±s)

討 論

腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)是目前發(fā)現(xiàn)的活性很強(qiáng)的廣譜營(yíng)養(yǎng)因子，其對(duì)神經(jīng)元和軟組織均有顯著的營(yíng)養(yǎng)活性，可增進(jìn)代謝，促進(jìn)細(xì)胞存活[5-6]。BDNF分子是由119個(gè)氨基酸殘基組成的分泌型堿性蛋白質(zhì)，分子量為13.15kU，主要由β折疊和無規(guī)則結(jié)構(gòu)組成，兩個(gè)相同的BDNF分子以共價(jià)鍵形式結(jié)合形成活性二聚體，通過配體-受體結(jié)合方式，激活信號(hào)傳導(dǎo)，發(fā)揮功能作用[7]。既往研究表明BDNF對(duì)維持神經(jīng)細(xì)胞和軟組織的存活以及引導(dǎo)細(xì)胞再生有重要意義，軟組織損傷后BDNF表達(dá)上調(diào)，并且受神經(jīng)活動(dòng)及遞質(zhì)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，BDNF對(duì)損傷組織具有顯著的修復(fù)功能[8-10]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察受損的腓腸肌肌肉肌腱接頭處形態(tài)學(xué)變化和BDNF變化來說明組織修復(fù)情況，評(píng)價(jià)內(nèi)熱針的治療效果，為臨床治療篩選優(yōu)秀治療措施。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，內(nèi)熱針組中組織形態(tài)學(xué)變化較快，恢復(fù)顯著，提示組織恢復(fù)速度快；損傷對(duì)照組在3-28d BDNF表達(dá)隨時(shí)間緩慢，持續(xù)性增加，說明組織不斷在進(jìn)行自我修復(fù)；內(nèi)熱針組3d時(shí)BDNF含量升高，但與損傷對(duì)照組間無明顯差異(P>0.05)；7、14d，內(nèi)熱針組顯著高于損傷對(duì)照組(P<0.05)，說明針刺加熱治療可明顯促進(jìn)受損局部BDNF表達(dá)，減輕組織變性壞死程度，加速恢復(fù)；28d，內(nèi)熱針組表達(dá)低于損傷對(duì)照組(P<0.05)，說明內(nèi)熱針組中組織恢復(fù)已進(jìn)入后期或基本完成，提示內(nèi)熱針組可明顯加快組織恢復(fù)進(jìn)程，縮短組織修復(fù)所需時(shí)間?？傊槾毯銣刂委熆商岣連DNF表達(dá)，促進(jìn)損傷組織生長(zhǎng)修復(fù)。

慢性軟組織損傷在臨床上很常見，可因直接或間接頓戳傷引起，會(huì)明顯降低生活質(zhì)量。內(nèi)熱針療法是以病變受損組織壓痛點(diǎn)分布為依據(jù)，嚴(yán)格按照解剖對(duì)壓痛點(diǎn)進(jìn)行密集型針刺[3]，該療法主要是利用針熱傳導(dǎo)性將熱量導(dǎo)入組織深部，促進(jìn)其恢復(fù)。這可能是內(nèi)熱針治療可顯著提高組織恢復(fù)能力的原因。本實(shí)驗(yàn)研究表明內(nèi)熱針療法可改善組織局部微循環(huán)、促進(jìn)炎性反應(yīng)，加速受損組織修復(fù)速度，縮短組織恢復(fù)所需時(shí)間，但本實(shí)驗(yàn)只對(duì)損傷組織只進(jìn)行了內(nèi)熱針治療，未與其他治療方法相比較，其治療效果優(yōu)劣有待進(jìn)一步研究。

1 王飛，高謙，王剛，等. 軟組織內(nèi)熱治療針體外溫度變化的特點(diǎn)分析［J］. 軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，31（1）：78-79．

2 Kami K，Masuhara M，Kashiba H，et al. Changes of vinculin and extracellular matrix components following blunt trauma to rat skeletal muscle［J］. Med Sci Sports Exerc，1993，25（7）：832-840.

3 楊志麗，高謙，王剛，等. 軟組織內(nèi)熱針與銀質(zhì)針對(duì)大鼠骨骼肌慢性損傷后SOD、MDA水平的影響［J］. 中華保健醫(yī)學(xué)雜志，2011，13（1）：28-30.

4 李光華，劉宏鵬，周旭，等. 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)坐骨神經(jīng)損傷小鼠神經(jīng)形態(tài)和功能恢復(fù)影響的研究［J］．中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2010，25（1）：23-26．

5 Junger H，Junger WG. CNTF and GDNF，but not NT-4，support corticospinal motor neuron growth via direct mechanisms［J］.Neuroreport，1998，9（16）：3749-3754.

6 李巖，李平，周震，等. 火針對(duì)坐骨神經(jīng)損傷模型大鼠COX-2、IL-1β、BDNF表達(dá)的干預(yù)研究［J］. 針灸臨床雜志，2007，23（12）：36-39.

7 Nakahashi T，F(xiàn)ujimura H，Altar CA，et al. Vascular endothelial cells synthesize and secrete brain-derived neurotrophic factor［J］.FEBS Lett，2000，470（2）：113-117.

8 韓艷秋，饒明俐，賈治. BDNF和NT-3在糖尿病周圍神經(jīng)病大鼠肌肉中的表達(dá)［J］. 中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2006 ，23（1）：65-67.

9 蘇立強(qiáng)，陳建萍，張瑋，等. 神經(jīng)生長(zhǎng)因子和電刺激對(duì)去大鼠腓腸肌組織結(jié)構(gòu)和肌纖維類型的影響［J］. 中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐，2008，14（11）：1036-1037.

10 Griesbeck O，Parsadanian AS，Sendtner M，et al. Expression of neurotrophins in skeletal muscle：quantitative comparison and significance for motoneuron survival and maintenance of function［J］.J Neurosci Res，1995，42（1）：21-33.