Bcl2-siRNA提高人肺腺癌細(xì)胞A549/DDP對(duì)順鉑敏感性的研究

張學(xué)林，余秉翔

解放軍總醫(yī)院 呼吸科，北京 100853

siRNA(small interfering RNA)是一種長(zhǎng)約21-25bp的小RNA分子，由Dicer(RNAse Ⅲ家族中對(duì)雙鏈RNA具有特異性的酶)加工而成，是RNA干擾(RNA interference，RNAi)途徑中的中間產(chǎn)物，siRNA通過(guò)與一系列特異性蛋白質(zhì)結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)，再由RISC切割靶mRNA最終導(dǎo)致翻譯受阻，產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄后基因沉默效應(yīng)(PTGS)。在細(xì)胞內(nèi)，siRNA能在低于反義核苷酸幾個(gè)數(shù)量級(jí)的濃度下，使靶基因表達(dá)水平降低，甚至可達(dá)完全“敲除”的效果[1]。肺癌在我國(guó)的發(fā)病率與死亡率已居惡性腫瘤之首，其中非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)占80%以上，其五年生存率僅8%-10%，65%患者診斷時(shí)已為晚期[2]。鉑類藥物聯(lián)合其他化療藥物是治療NSCLC的主要方案，但是多藥耐藥現(xiàn)象影響化療療效[3-4]。越來(lái)越多研究表明Bcl-2基因與腫瘤耐藥關(guān)系密切。本研究以人肺腺癌順鉑耐藥細(xì)胞A549/DDP及其親本細(xì)胞A549為模型，通過(guò)siRNA降低腫瘤細(xì)胞中Bcl2 mRNA及蛋白的表達(dá)，進(jìn)而增加A549/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，為研究肺癌順鉑耐藥提供依據(jù)。

材料和方法

1 試劑與儀器 注射用順鉑(凍干型)為齊魯制藥產(chǎn)品；jetPRIME轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于PolyPlus-transfection公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8)購(gòu)自DOJINDO公司；TRI Reagent購(gòu)自Sigma公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于Promega 公司；熒光PCR試劑購(gòu)于TaKaRa公司；Bcl-2、GAPDH抗體購(gòu)于Santa Cruz公司。siRNA由上海吉瑪公司合成(Negative Control RNA序 列 為 ：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。siBcl-2序 列[5]為 ：5'-UGUGGAUGACUGAGUACCUGAdTdT-3'，5'-UCAGGUACUCAGUCAUCCACAdTdT-3')； 其 余試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。Mx3000p熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀由Stratagene生產(chǎn)；MS酶標(biāo)儀由芬蘭Labsystems生產(chǎn)。

2 細(xì)胞株培養(yǎng) 人肺腺癌順鉑耐藥細(xì)胞株A549/DDP及其親本細(xì)胞株A549(ATCC)購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所。細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)液加含10%胎牛血清(Hyclone)和100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素，于37℃、5% CO2孵箱中孵育。為保持A549/DDP細(xì)胞耐藥性，在新鮮配置的含1μg/ml順鉑培養(yǎng)液中培養(yǎng)，常規(guī)消化、傳代。實(shí)驗(yàn)前2d，A549/DDP細(xì)胞培養(yǎng)液換為不含順鉑培養(yǎng)液。

3 測(cè)定A549/DDP耐藥系數(shù) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549/DDP細(xì)胞和A549細(xì)胞鋪于96孔板，每孔3.0×103個(gè)細(xì)胞，16h后換為含不同濃度順鉑的培養(yǎng)液，A549培養(yǎng)液順鉑濃度為(0、0.5、1、1.5、2、3μg/ml)，A549/DDP培養(yǎng)液順鉑濃度為(0、3、6、9、12、15μg/ml)，每個(gè)濃度5個(gè)復(fù)孔。藥物作用48h后，換為新鮮配置的含10% CCK-8液的培養(yǎng)液100μl，置孵箱繼續(xù)培養(yǎng)，1h后用多功能酶標(biāo)儀于450nm波長(zhǎng)下檢測(cè)每孔吸光度值(A)。按公式計(jì)算每個(gè)濃度的順鉑對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率(IR)：IR(%)＝(1-Ai/A0)×100%(Ai為各濃度順鉑組的平均吸光值，A0為不加順鉑組的平均吸光值)。并計(jì)算順鉑對(duì)細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。耐藥系數(shù)RI=IC50A549/DDP/IC50A549。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

4 轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549/DDP細(xì)胞接種于6孔板，每孔1.0×105個(gè)細(xì)胞，接種16h后采用jetPRIME轉(zhuǎn)染試劑，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。每孔轉(zhuǎn)染雙鏈RNA終濃度為20nmol/L。轉(zhuǎn)染24h后換為不含順鉑的正常培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)分陰性對(duì)照組(NC組)和轉(zhuǎn)染siBcl-2組。

5 Real time RT-PCR檢測(cè)Bcl-2 mRNA的表達(dá)水平總RNA的提取采用TRI Reagent法，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。總RNA提取后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照說(shuō)明書(shū)操作。以GAPDH為內(nèi)參照擴(kuò)增Bcl-2基因。GAPDH上 游 引 物：5'-TCAGTGGTGGACCTGACCTG-3'， 下 游 引 物：5'-TGCTGTAGCCAAATTCGTTG-3'。Bcl-2上 游 引 物：5'-GGATGCCTTTGTGGAACTGT-3'， 下 游 引 物：5'-AGCCTGCAGCTTTGTTTCAT-3'。用2-ΔΔCt方法處理實(shí)時(shí)定量數(shù)據(jù)，計(jì)算Bcl-2 mRNA的表達(dá)差異。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

6 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染32h后，接種于96孔板，每孔3.0×103個(gè)細(xì)胞，接種16h后換為新鮮配置的含不同濃度順鉑的培養(yǎng)液(0、3、6、9、12、15μg/ml)，藥物作用48h后，按方法3測(cè)吸光度A值，并計(jì)算兩組的IC50值，比較轉(zhuǎn)染siBcl-2后A549/DDP對(duì)順鉑敏感性的變化。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

7 Western Blot檢測(cè)Bcl-2蛋白的表達(dá) 用RIPA裂解液收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度后，利用10%的SDS-PAGE膠進(jìn)行分離等量蛋白，然后轉(zhuǎn)膜、封閉，加入1∶1 000稀釋的兔抗人Bcl-2單克隆抗體，以及1∶5 000稀釋的二抗。最后加入發(fā)光試劑，曝光、顯影。以GAPDH為內(nèi)參照。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以-x±s表示，兩組獨(dú)立樣本采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 A549/DDP細(xì)胞耐藥系數(shù)測(cè)定 加藥48h后，順鉑(DDP)對(duì)A549及A549/DDP細(xì)胞的增殖均有抑制作用(圖1、2)。順鉑對(duì)A549細(xì)胞的IC50值為(1.68±0.26)μg/ml，對(duì)A549/DDP細(xì)胞的IC50值為(10.92±1.15)μg/ml，A549/DDP細(xì)胞的耐藥系數(shù)為6.49(P<0.05)(圖3)。

2 Bcl-2 mRNA及蛋白在A549及A549/DDP細(xì)胞中的差異表達(dá) 提取細(xì)胞中RNA后，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄及Real time RT-PCR檢測(cè)Bcl-2 mRNA的表達(dá)。Bcl-2 mRNA在A549/DDP細(xì)胞中的表達(dá)水平是A549細(xì)胞的3.77±0.56倍(P<0.05)(圖4)。收集6孔板中A549及A549/DDP細(xì)胞，以GAPDH為內(nèi)參照，檢測(cè)兩者之間Bcl-2蛋白的差異，由圖5示，A549/DDP細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)明顯高于A549細(xì)胞。

3 siBcl-2的干涉效果 在A549/DDP細(xì)胞中轉(zhuǎn)染雙鏈RNA 48h后，siBcl-2組同NC組相比，Bcl-2 mRNA表達(dá)水平降低了92.6%(P<0.05)(圖6)，其蛋白表達(dá)也明顯降低(圖7)，幾乎達(dá)到“敲出”該基因的效果，說(shuō)明其干涉效果良好。

4 轉(zhuǎn)染siBcl-2后A549/DDP對(duì)順鉑的敏感性 在A549/DDP細(xì)胞中轉(zhuǎn)染RNA后，siBcl-2組順鉑的IC50值為(4.83±0.76)μg/ml；NC組順鉑的IC50值為(11.47±1.02)μg/ml；敏感性提高了57.8%(P<0.05)(圖 8、9)。

圖 1 順鉑對(duì)A549細(xì)胞的抑制率 圖 2 順鉑對(duì)A549/DDP細(xì)胞的抑制率 圖 3 順鉑對(duì)A549及A549/DDP細(xì)胞的IC50值Fig 1 Cisplatin-inhibiting rate for A549 cells Fig 2 Cisplatin-inhibiting rate for A549/DDP cell Fig 3 IC50 value of cisplatin for A549 and A549/DDP cells

圖 4 Bcl-2 mRNA在A549及A549/ 圖 5 Bcl-2 蛋白在A549及A549/DDP 圖 6 轉(zhuǎn)染后A549/DDP細(xì)胞中Bcl-2 mRNA DDP細(xì)胞中的表達(dá) 細(xì)胞中的表達(dá) 的表達(dá)Fig 4 Expression of Bcl-2 mRNA in A549 and A549/DDP cells Fig 5 Expression of Bcl-2 protein in A549(1) and A549/DDP(2)cells 1: The protein level in A549 cells; 2: The protein level in A549/DDP cells Fig 6 Expression of Bcl-2 mRNA in A549/DDP cells after transfection NC: The Bcl-2 mRNA level in A549/DDP cells after transfection of negative control RNA; siBcl-2: The Bcl-2 mRNA level in A549/DDP cells after transfection of siBcl-2 RNA

圖 7 轉(zhuǎn)染后Bcl-2 蛋白在A549/DDP 圖 8 轉(zhuǎn)染后順鉑對(duì)A549/DDP細(xì)胞 圖 9 轉(zhuǎn)染后順鉑對(duì)A549/DDP細(xì)胞的IC50值細(xì)胞中的表達(dá) 的抑制率Fig 7 Expression of Bcl-2 protein in A549/DDP cells after transfection 1: The protein level in A549/DDP cells after transfetion of negative control RNA; 2: The protein level in A549/DDP cells after transfetion of siBcl-2 RNA Fig 8 Cisplatin-inhibiting rate for A549/DDP cells after transfection NC: The inhibition rate after transfection of negative control RNA; siBcl-2: The inhibition rate after transfection of siBcl-2 RNA Fig 9 IC50 value of cisplatin for A549/DDP cells after transfection NC: The IC50 value after transfection of negative control RNA; siBcl-2: The IC50 value after transfection of siBcl-2 RNA

討 論

肺癌耐藥的機(jī)制十分復(fù)雜，至今仍未完全闡明，有多種基因參與此過(guò)程，其中Bcl-2基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[6]。Bcl-2(B-cell lymphoma/leukemia-2，B細(xì)胞淋巴瘤/白血病)基因，是1984年Jsujimoto等在研究B細(xì)胞濾泡性淋巴瘤中分離出來(lái)的一種原癌基因。正常的Bcl-2基因定位于染色體18q1.3上，大小約230kb。該基因編碼26×103kDa大小的蛋白，位于線粒體膜、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜上。該基因能抑制諸如抗腫瘤藥等凋亡信號(hào)引起的細(xì)胞凋亡[7]。有數(shù)據(jù)顯示，Bcl-2基因的高表達(dá)導(dǎo)致多種腫瘤對(duì)化療藥物耐藥[8]。Bcl-2不阻止藥物進(jìn)入細(xì)胞，不抑制藥物引起的DNA損傷，也不改變細(xì)胞對(duì)DNA的修復(fù)速率和細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)，該基因?qū)е履退幍臋C(jī)制主要是通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡途徑實(shí)現(xiàn)的[9]。

有報(bào)道，Bcl-2基因的高表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤對(duì)化療藥物的耐藥有關(guān)[10]。Bcl-2低表達(dá)的卵巢癌對(duì)化療反應(yīng)良好[11]。戴明等[12]發(fā)現(xiàn)人肺腺癌細(xì)胞紫杉醇耐藥與Bcl-2高表達(dá)有關(guān)。但是也有報(bào)道稱Bcl-2的低表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞MCF-7多西他賽耐藥有關(guān)[13]。

本研究中我們以人肺腺癌順鉑耐藥細(xì)胞A549/DDP及其親本細(xì)胞A549為模型，發(fā)現(xiàn)A549/DDP中Bcl-2 mRNA表達(dá)的表達(dá)量為A549的3.77±0.56倍，其蛋白表達(dá)量也明顯升高。通過(guò)在A549/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染Bcl2-siRNA，使Bcl-2 mRNA及蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)明顯降低，從而使順鉑對(duì)A549/DDP細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC50由(11.47±1.02)μg/ml下降到(4.83±0.76)μg/ml，大大提高A549/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。說(shuō)明Bcl-2基因的表達(dá)與肺癌耐藥關(guān)系密切，同時(shí)，本研究也證實(shí)了Bcl2-siRNA對(duì)于逆轉(zhuǎn)肺腺癌順鉑耐藥具有確切的作用，為肺癌耐藥這一難題的攻克提供理論依據(jù)。

1 Brummelkamp TR，Bernards R，Agami R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells［J］.Science，2002，296（5567）：550-553.

2 馬春燕，宋勇. EGFR-TKI治療非小細(xì)胞肺癌的問(wèn)題與對(duì)策［J］.藥學(xué)與臨床研究，2010，18（2）：112-117.

3 Jemal A，Siegel R，Xu J，et al. Cancer statistics，2010［J］. CA Cancer J Clin，2010，60（5）：277-300.

4 Lage H. An overview of cancer multidrug resistance：a still unsolved problem［J］. Cell Mol Life Sci，2008，65（20）：3145-3167.

5 Cao N，Cheng D，Zou S，et al. The synergistic effect of hierarchical assemblies of siRNA and chemotherapeutic drugs co-delivered into hepatic cancer cells［J］. Biomaterials，2011，32（8）：2222-2232.

6 Stavrovskaya AA. Cellular mechanisms of multidrug resistance of tumor cells［J］. Biochemistry（Mosc），2000，65（1）：95-106.

7 劉暢，張杰. BcL2與婦科腫瘤的關(guān)系［J］. 中國(guó)冶金工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2006，23（5）：552-554.

8 Dive C. Avoidance of apoptosis as a mechanism of drug resistance［J］.J Intern Med Suppl，1997，740：139-145.

9 楊娜，韓玲. 白細(xì)胞介素2（IL-2）和白細(xì)胞介素12（IL-12）對(duì)肺腺癌細(xì)胞作用機(jī)制的研究［J］. 吉林醫(yī)學(xué)，2007，28（5）：603-606.

10 胡海燕，陸琳，郭紅波，等. Bcl2-siRNA 上調(diào)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞放療敏感性的研究［J］. 實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2010，26（15）：2688-2689.

11 鐘雪云，陳運(yùn)賢，林華歡，等. 卵巢上皮癌bcl-2，p53基因與多藥耐藥的相關(guān)研究［J］.實(shí)用腫瘤學(xué)雜志，2000，14（2）：82-84.

12 戴明，羅榮城，鐘華成，等. 紫杉醇耐藥人肺腺癌細(xì)胞系的建立及生物學(xué)活性［J］. 實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2007，23（18）：2826-2829.

13 Kastl L，Brown I，Schofield AC. miRNA-34a is associated with docetaxel resistance in human breast cancer cells［J］. Breast Cancer Res Treat，2012，131（2）：445-454.