視紫紅質(zhì)和Peripherin/RDS基因在視網(wǎng)膜色素變性家系中的突變檢測(cè)

章雪敏，劉鐵城，金 鑫，張寶全，徐 華

1解放軍總醫(yī)院 眼科，北京 100853；2四川省宣漢縣人民醫(yī)院 眼科，達(dá)州 636150

原發(fā)性視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)是視網(wǎng)膜感光細(xì)胞和色素上皮細(xì)胞變性導(dǎo)致夜盲和進(jìn)行性視野損害的遺傳性致盲眼病。我國發(fā)病率約為1/3 784[1]。RP的遺傳方式復(fù)雜多樣，非綜合征RP至少有4種遺傳方式，其中15%-25%為常染色體顯性遺傳(adRP)，5%-20%為常染色體隱性遺傳 (autosomal recessive RP，arRP)，5%-15%為X-連鎖遺傳(X-linked RP，XLRP)，另有5%早發(fā)型RP即隱性Leber's先天性黑蒙(LCAⅡ型)。當(dāng)患者因缺乏家族史無法確定其遺傳方式時(shí)，將其定義為散發(fā)型RP(sporadic RP，SRP)，約占40%-50%[2]。多數(shù)RP為單基因遺傳，但也存在二基因－雙等位基因和二基因－三等位基因遺傳方式[3]。迄今為止，發(fā)現(xiàn)與RP有關(guān)的致病基因共59個(gè)，其中adRP 23個(gè)[4]。本研究對(duì)一個(gè)常染色體顯性視網(wǎng)膜色素變性家系成員進(jìn)行RHO、Peripherin/RDS、ROM1、NRL和CRX 5個(gè)常見候選基因檢測(cè)，在分子水平闡述該家系的發(fā)病機(jī)制。

對(duì)象和方法

1 對(duì)象 本研究家系來自四川省達(dá)州市普光縣，5代46名成員，已采集外周血的成員為28名，其中6名RP患者、1名疑似成員和21名正常成員。該家系RP性狀連續(xù)3代傳遞，男女均可發(fā)病，發(fā)病比例為1∶5，符合常染色體完全顯性遺傳特征。

2 臨床資料采集 按照RP診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]詢問家系成員病史，繪制家系圖譜(圖1)，確定疾病遺傳類型，所有研究對(duì)象均行視力、眼壓、房角、晶狀體、眼底、視野及視網(wǎng)膜電圖(electroretinography，ERG)等檢查。分析家系的臨床特點(diǎn)：患者年齡33-79歲，出現(xiàn)夜盲時(shí)間為5-15歲。視野損害出現(xiàn)時(shí)間各異，患者II：1、Ⅲ：1和Ⅳ：1無視野縮小病史。Ⅲ：1和Ⅲ：3出現(xiàn)紅色覺減弱。Ⅲ：5和Ⅲ：7虹膜膨隆，房角為窄角Ⅲ-Ⅳ級(jí)，但眼壓均正常。Ⅲ：1、Ⅲ：3、Ⅲ：5和Ⅲ：7出現(xiàn)并發(fā)性白內(nèi)障。Ⅲ：1和Ⅲ：3玻璃體呈煙灰樣混濁。除II：1外，所有患者黃斑區(qū)均出現(xiàn)骨細(xì)胞樣色素沉著。疑似成員Ⅴ：1為11歲男性，父母訴其5歲出現(xiàn)夜盲，眼部檢查未見異常。采集到血樣的21名正常成員為Ⅲ：2、Ⅲ：4、Ⅲ：6、Ⅲ：9、Ⅳ：2-Ⅳ：6、Ⅳ：12、Ⅳ：13、Ⅳ：17、Ⅳ：18、Ⅴ：2-Ⅴ：9，眼底均未見異常。

3 外周血DNA制備 本研究通過解放軍總醫(yī)院倫理委員會(huì)論證，所有受檢者簽署知情同意書。抽取該家系中6名患者、1名疑似成員和21名正常成員外周靜脈血8-10ml，EDTA抗凝。DNA抽提采用天根生化科技(北京)有限公司提供的離心柱型血液基因組DNA抽提試劑盒，按操作方法提取外周血白細(xì)胞DNA，-80℃保存待用。

4 PCR擴(kuò)增 采用Primer3軟件在線設(shè)計(jì)RHO、Peripherin/RDS、ROM1、NRL和CRX基因的 16個(gè)外顯子及其與內(nèi)含子交界處序列的引物[6-8]，引物由北京奧科生物技術(shù)公司合成。PCR反應(yīng)在25μl體系中進(jìn)行：2×Taq PCR MasterMix(含染料，藍(lán)色)12.5μl，正反向引物各5μl(引物原液加滅菌ddH2O稀釋50倍)，DNA模板2.5μl(模板原液)。反應(yīng)條件：94℃ 3min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃1min，共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠/紫外線鑒定，證實(shí)PCR擴(kuò)增片段存在。

5 測(cè)序結(jié)果分析 將所得PCR產(chǎn)物送至北京中美泰和生物技術(shù)有限公司測(cè)序，所得結(jié)果使用Chromas軟件、GeneTool軟件和在線BLAST程序(http//www.ncbi.nlm.govBLAST)進(jìn)行閱讀和堿基序列比對(duì)。

結(jié) 果

該家系患者擴(kuò)增產(chǎn)物在RHO、Peripherin/RDS、ROM1、NRL和CRX基因中未發(fā)現(xiàn)致病突變，但在Peripherin/RDS基因第1外顯子(exon)和第3外顯子編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)4處單核苷酸改變，屬于單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)。在正常成員中，這些部位的氨基酸均和美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)數(shù)據(jù)庫上公布的標(biāo)準(zhǔn)序列一致。如表1所示。相對(duì)應(yīng)的峰圖見圖2。

表1 Peripherin/RDS基因測(cè)序結(jié)果Tab 1 Peripherin/RDS gene sequencing

討 論

圖1 adRP家系圖譜系譜圖注釋：Fig 1 Pedigree of adRPNote:

圖2 SNPs測(cè)序峰圖Fig 2 Sequencing picture of SNP

據(jù)報(bào)道[9]，RHO和Peripherin/RDS基因分別占adRP致病基因的25%-30%和5%-10%，因此，本研究首先選取ROH(Exon1-5)、Peripherin/RDS(Exon 1-3)、ROMI(Exon1-3)、CRX(Exon2-4)和NRL(Exon2、3)基因的16個(gè)外顯子進(jìn)行初步篩查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Peripherin/RDS基因上存在4處SNPs：910C>G、929G>A和1013A>G為 錯(cuò) 義 突 變， 對(duì)應(yīng)的氨基酸改變?yōu)椋篏ln304Glu、Arg310Lys和Asp338Gly；318T>C為同義突變。其余候選基因未發(fā)現(xiàn)堿基改變。

RHO基因定位于3q21-q24，由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成，長約6952bp，編碼由348個(gè)氨基酸組成的視紫紅質(zhì)(rhodopsin，RHO)蛋白，該蛋白僅在視桿光感受器細(xì)胞中專一性表達(dá)，與RP發(fā)病早期即存在視桿細(xì)胞變性相一致[10]。目前，已發(fā)現(xiàn)100余種[6]RHO突變與RP有關(guān)，在這些突變譜中，90%以上是單個(gè)堿基突變，少數(shù)是小片段的插入或缺失突變(Indel)，一般不超過20個(gè)堿基。研究表明，Pro23His和Pro347Leu突變?cè)跉W美最為常見，Pro347Leu突變?cè)谖覈^常見[11]。RHO基因突變率存在地區(qū)差異，我國低于歐美，約占adRP致病基因的7%[12]。本研究RHO基因未發(fā)現(xiàn)堿基改變，確定該基因與本研究adRP家系臨床表型無關(guān)。

Peripherin/RDS 基因位于 6p21[13]，cDNA長 3 212個(gè)堿基，由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成，編碼由346個(gè)氨基酸組成的盤膜周邊蛋白，表達(dá)于光感受器細(xì)胞內(nèi)，其功能可能與光感受器的發(fā)生有關(guān)，并且維持外節(jié)盤緣的結(jié)構(gòu)及其穩(wěn)定性。Peripherin/RDS基因突變最重要的特點(diǎn)是疾病表型多樣化，目前，公認(rèn)的觀點(diǎn)是由于修飾位點(diǎn)的存在和環(huán)境因素的影響所致[14]。Peripherin/RDS基因突變引起的表型改變可以分為四類：ADRP、進(jìn)行性黃斑變性、雙基因RP和視網(wǎng)膜圖形樣變性，該基因內(nèi)不同位點(diǎn)和突變類型引起疾病的嚴(yán)重程度不同：第三和四跨膜區(qū)之間的錯(cuò)義突變和讀框缺失引起ADRP和嚴(yán)重黃斑變性；分布于整個(gè)Peripherin/RDS基因的無意義突變引起圖形樣黃斑變性和雙基因RP。本研究未發(fā)現(xiàn)該家系在Peripherin/RDS基因中存在致病突變，但在Peripherin/RDS基因外顯子1和3編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)4處SNPs，均不與疾病共分離。說明Peripherin/RDS基因存在遺傳異質(zhì)性。

本研究家系患者臨床表型差異性明顯，其原因可能是由于核苷酸堿基的單倍體不同，或順式或反式等位基因不同，也可能是環(huán)境因素影響了致病基因的突變，從而影響疾病的臨床表型[15]?，F(xiàn)通過直接測(cè)序的方法已排除RHO、Peripherin/RDS、ROM1、NRL和CRX基因與該家系臨床表型相關(guān)，Peripherin/RDS基因外顯子區(qū)發(fā)現(xiàn)的4處SNPs，與dbSNP數(shù)據(jù)庫中(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)的記錄進(jìn)行比對(duì)，未發(fā)現(xiàn)與本研究相同的SNP位點(diǎn)，因此，本研究發(fā)現(xiàn)的SNPs有可能是新的SNP位點(diǎn)。我們下一步的工作是，繼續(xù)對(duì)剩余的18個(gè)adRP候選基因進(jìn)行檢測(cè)，鑒于用Sanger測(cè)序法工作量大，所需時(shí)間長，因此采用高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行后續(xù)工作(另文報(bào)告)。本家系表型差異性大，不排除存在新的致病基因的可能。

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