小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后在炎癥性腸病模型的定位

陳倩倩，萬 軍，閻 麗，王衛(wèi)華，王昌正，石 卉，蘇斌斌，曾慶環(huán)，杜海濤

解放軍總醫(yī)院 南樓消化科，北京 100853

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerativecolitis，UC)和克羅恩病(Crohn′s disease，CD)，是一種病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明了的慢性腸道炎性疾病，近年來其發(fā)病呈上升趨勢。目前的治療手段包括抗炎藥物、激素、免疫抑制劑及生物治療等，但療效不佳。國外有報(bào)道[1]稱造血干細(xì)胞移植治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤合并IBD的案例，移植后其IBD癥狀也隨之得到緩解，這為IBD的治療提供了一種新的選擇。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)具有自我更新、多向分化功能，在特定條件下可誘導(dǎo)成為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞等，還可向神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞分化[2]。本實(shí)驗(yàn)以2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)作為灌腸劑，構(gòu)建小鼠炎癥性腸病模型，以小鼠的BMSCs為細(xì)胞源，經(jīng)尾靜脈途徑進(jìn)行移植，并觀察其在腸道損傷部位的定植情況。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/C小鼠，6-8周齡，雌性，SPF級，用于制作IBD動(dòng)物模型；BALB/C小鼠，2-3周齡，雄性，SPF級，用于提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；均由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 2，4，6-三硝基苯磺酸(Sigma公司)；低糖改良Eagle完全培養(yǎng)基(Hyclone公司)；0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA(Gibco公司)；頂級胎牛血清(Gibco公司)；油紅-O(Sigma公司)；茜素紅S(Sigma公司)；CFDA SE(上海奔大生物科技有限公司)；DNA提取試劑盒(Omega公司)；倒置相差熒光顯微鏡及照相系統(tǒng)(日本Olympus公司)；PCR儀(Eppendorf公司)。

3 小鼠骨髓MSCs的分離培養(yǎng)[3]用斷頸法處死小鼠，乙醇浸泡鼠體2min，在超凈臺中取出四肢骨并將其附著肌肉組織剝離干凈，低糖改良Eagle完全培養(yǎng)基(LG-DMEM)浸泡。用1ml注射器分別在骨兩端鉆一小孔，用LG-DMEM反復(fù)沖洗骨髓腔至四肢骨干呈略帶透明狀，取出四肢骨用手術(shù)剪將其剪成1-3mm3的骨片后，將其移入5ml小瓶中并加入3ml LG-DMEM(含雙抗)及1mg/ml(wt/vol)膠原酶Ⅱ，置于37℃恒溫?fù)u床上以200r/min速度搖1-2h后中止消化，并洗滌3次后加入6ml含10%胎牛血清(FBS)的LG-DMEM置于37℃，5%CO2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。靜置3d后首次換液，并除去未貼壁的細(xì)胞及骨組織。原代培養(yǎng)第5天進(jìn)行傳代，加入1ml 0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA，細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化1min，以1∶2進(jìn)行傳代。此后每2d換1次液，待細(xì)胞生長滿培養(yǎng)皿的80%-90%可進(jìn)行傳代。

4 小鼠骨髓MSCs的標(biāo)記 取第3代BMSCs進(jìn)行熒光標(biāo)記，用1ml CFDA SE細(xì)胞標(biāo)記液懸浮2×106/細(xì)胞，加入1ml CFDA SE儲存液(2×)，37℃孵育10min后加入完全細(xì)胞培養(yǎng)液(含血清)終止，PBS洗滌2次后，用2ml PBS重懸細(xì)胞，備用；經(jīng)過標(biāo)記的細(xì)胞可按正常方法進(jìn)行培養(yǎng)，在熒光顯微鏡下直接觀察標(biāo)記效果。

5 IBD模型構(gòu)建及分組 參考文獻(xiàn)[4]方法加以改進(jìn)：將小鼠隨機(jī)分為3組：對照組(n=12)：給予0.9%氯化鈉溶液100μl灌腸后第2天給予尾靜脈移植BMSCs；TNBS組(n=12)：給予TNBS 2.0mg/50%乙醇灌腸劑 100μl；TNBS-MSCs移植組(n=12)：給予TNBS 2.0mg/50%乙醇灌腸劑100μl，并于造模后第2天給予尾靜脈移植BMSCs。小鼠禁食不禁飲，48h后稱重。用左手固定小鼠，右手將2.5cm靜脈留置針經(jīng)小鼠肛門輕輕插入結(jié)腸，至套管頂端距離肛門約2.5cm，立即將連有1ml注射器的套管針內(nèi)芯插入套管，使小鼠倒立，分別緩緩注入TNBS 2.0mg/50%乙醇灌腸劑100μl，拔出套管針，使小鼠保持倒立姿態(tài)60s后放入籠中，對照組給予0.9%氯化鈉溶液。此后每隔1d測量小鼠體重變化情況。

6 細(xì)胞移植及取材 造模后第1天，TNBS-MSCs移植組小鼠均經(jīng)尾靜脈注射0.1ml CFDA SE標(biāo)記的BMSCs懸液(含有1×106細(xì)胞)。于移植后第2、5、9天各處死4只，取遠(yuǎn)端結(jié)腸組織，0.9%氯化鈉溶液沖洗腸道內(nèi)容物，觀察腸道大體形態(tài)變化。一部分制成冰凍切片，在熒光顯微鏡下觀察腸道熒光定植情況，及進(jìn)行HE染色觀察腸道病理變化；另一部分用于提取DNA進(jìn)行SRY基因檢測。

7 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 分別提取移植后第9天的TNBS組、TNBS-MSCs移植組及用于提取干細(xì)胞的雄性小鼠結(jié)腸組織DNA后，采用PCR技術(shù)檢測Y染色體的性別決定區(qū)(SRY)基因，觀察BMSCs在受體結(jié)腸組織的植入情況。引物由primer3軟件設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程公司合成，上游引物序列為5'-GGTGTGGTCCCGTGGTGAGAG-3'，下游引物序列為5'-ATGGCATGTGGGTTCCTGTCC-3'，所得產(chǎn)物片斷為294bp。反應(yīng)體系為25μl，擴(kuò)增條件：94℃ /2min，35×(94℃ /20s，64℃ /20s，72℃ /20s)，72℃延伸5min。擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳，于Image Master VDS凝膠掃描儀上成像。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件。多組間數(shù)據(jù)用單因素方差分析，兩組間數(shù)據(jù)t檢驗(yàn)比較分析。

結(jié) 果

1 BMSCs形態(tài)學(xué)特點(diǎn) 原代培養(yǎng)可見貼壁細(xì)胞從骨片中爬出來，形態(tài)為小圓形、多角形、梭形、扁平形，增殖形成大小不等的克隆集落，并向周圍進(jìn)一步擴(kuò)展變大與鄰近的克隆集落融合，經(jīng)換液傳代后細(xì)胞形態(tài)較為一致，融合狀態(tài)時(shí)細(xì)胞排列呈束狀、旋渦狀或放射狀，見圖1A；用CFDA SE熒光標(biāo)記后幾乎所有BMSCs呈綠色熒光，見圖1B。2 IBD模型一般情況 TNBS組及TNBS-MSCs移植組的BALB/C小鼠造模24h后出現(xiàn)懶動(dòng)、身體蜷縮、扎堆、厭食、大便次數(shù)增多、多為稀便或血便、體重下降等情況，TNBS組小鼠此后3d上述癥狀不同程度加重，其中體重在第3天下降最為明顯，造模后第5天，上述癥狀逐漸改善。對照組小鼠則反應(yīng)靈活、食量正常、體重增加。TNBS-MSCs移植組小鼠于造模24h后給予尾靜脈移植BMSCs，并與移植后第2天體重開始上升，上述癥狀較前明顯好轉(zhuǎn)直至恢復(fù)正常。各組小鼠體重變化見圖3。3 IBD模型病理 造模后第3天，遠(yuǎn)端結(jié)腸腸壁大部分結(jié)構(gòu)破壞，明顯充血、水腫、伴有點(diǎn)狀或片狀出血，多發(fā)潰瘍形成，糜爛、壞死，多呈節(jié)段性，部分腸管狹窄(圖2A)；光鏡下為腸黏膜充血水腫、上皮脫落、潰瘍、糜爛、壞死、出血，部分潰瘍深達(dá)黏膜全層，黏膜下層有大量中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(圖2C)。正常對照組腸壁表面光滑，結(jié)構(gòu)完整(圖2B)；光鏡下可見腸道黏膜完整、無破壞，腸腺開口清晰，腺管表面界溝明顯，可見杯狀細(xì)胞和吸收細(xì)胞，無炎癥細(xì)胞浸潤(圖2D)。

4 CFDA SE標(biāo)記的BMSCs移植后在腸道的分布TNBS-MSCs移植組綠色熒光標(biāo)記的BMSCs較多分布在腸道潰瘍壞死病灶周邊(圖3)，而對照組無潰瘍壞死的正常腸道黏膜無BMSCs定植。

5 SRY基因在各組小鼠腸道內(nèi)的檢測 在移植后的第9天TNBS-MSCs移植組及雄性小鼠對照組均能檢測到SRY基因，在TNBS組不能檢測到該基因，見圖4。

討 論

近年來，隨著干細(xì)胞研究的深入，MSCs移植已被用來治療心血管系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、消化系統(tǒng)疾病及自身免疫性疾病等[5-7]，并取得了一定的治療效果。本實(shí)驗(yàn)采用骨片培養(yǎng)法獲得生長迅速、純度較高、生物活性好的BMSCs，采用成脂肪、成骨誘導(dǎo)分化的方法來鑒定BMSCs的多向分化能力，從而證明該細(xì)胞為骨髓中的多能干細(xì)胞；而且也表明經(jīng)過體外傳代后BMSC仍然保持其多向分化的能力。目前炎癥性腸病的動(dòng)物模型很多，本實(shí)驗(yàn)采用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)復(fù)制出類似人發(fā)病的模型，該模型具有操作簡便、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、重復(fù)性好、造型時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。病理學(xué)改變也與人發(fā)病相似，發(fā)病時(shí)可見結(jié)腸黏膜毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血、水腫，大量的中性白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤，并可見點(diǎn)狀或片狀出血點(diǎn)。黏膜腺體正常結(jié)構(gòu)破壞，腺細(xì)胞減少或消失，有隱窩膿腫及潰瘍形成。

BMSCs還具有向骨髓歸巢及損傷部位遷移的特性[8]，植入細(xì)胞在受體內(nèi)的歸巢，對于鑒定細(xì)胞移植是否成功至關(guān)重要。經(jīng)尾靜脈移植的BMSCs經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)腸道損傷部位的機(jī)制可能是，BMSCs的黏附分子可在全身神經(jīng)-體液免疫系統(tǒng)調(diào)控下表達(dá)逐漸增強(qiáng)，并在受損傷部位炎癥介質(zhì)的引導(dǎo)下向損傷結(jié)腸部位附壁、游出、趨化，穿過血管內(nèi)皮屏障后定植于該部位并逐漸增多，為其促進(jìn)潰瘍部位再生修復(fù)奠定了基礎(chǔ)。但不是所有移植BMSCs都聚集于損傷結(jié)腸，其余細(xì)胞在趨化因子的作用下逐漸歸巢于骨髓，結(jié)腸以外器官內(nèi)干細(xì)胞逐漸減少。有研究顯示，BMSCs主要分布于腸道組織的黏膜層中[9]。本實(shí)驗(yàn)通過熒光顯微鏡觀察到CFDA SE標(biāo)記的BMSCs可以定植到腸道上皮細(xì)胞層或腸黏膜隱窩的結(jié)腸上皮祖細(xì)胞定居的部位，多數(shù)位于BMSCs多分布于黏膜潰瘍和糜爛處病灶周邊，而正常組織黏膜層、未移植組及重度損傷區(qū)域未見BMSCs定植。有實(shí)驗(yàn)[10]選擇雌性IBD模型小鼠為移植受體，以雄性小鼠的BMSCs為細(xì)胞源，選擇雄性基因SRY為分子標(biāo)志，采用PCR技術(shù)檢測植入細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)的歸巢，結(jié)果顯示在移植后第9天可檢測到SRY陽性細(xì)胞存在，而其相應(yīng)對照組則無信號顯示；但并不是在所有TNBS-MSCs移植組的結(jié)腸黏膜中能檢測到熒光或SRY基因表達(dá)，這可能與細(xì)胞增殖數(shù)量、細(xì)胞歸巢時(shí)間、取材及IBD模型組織損傷的輕重程度有關(guān)?？梢娨浦驳腂MSC可在受體內(nèi)存活并進(jìn)入局部組織微環(huán)境，但一方面存在BMSCs被血液稀釋可能最終進(jìn)入結(jié)腸組織的細(xì)胞數(shù)量有限；另一方面，經(jīng)外周移植的BMSCs不僅僅只在結(jié)腸分布，在經(jīng)過肺、肝等臟器時(shí)發(fā)生滯留。

表1 各組小鼠體質(zhì)量變化率Tab1 Weight of mice in different groups(-x±s)

圖1 BMSCs的培養(yǎng)及熒光標(biāo)記A：未標(biāo)記干細(xì)胞；B:熒光標(biāo)記干細(xì)胞Fig 1 Incubation and flourescent labelingA: Unlabeled MSCs; B: fluorescent labeled MSCs

圖2 腸道組織肉眼觀及HE染色A：IBD模型組腸道黏膜肉眼觀；B：對照組腸道黏膜肉眼觀；C：IBD模型腸道組織HE染色；D：對照組腸道組織HE染色Fig 2 HE staining of colon tissueA: Macroscopic observation of colon mucosa in IBD model group; B：Macroscopic observation of colon mucosa in control group; C: HE staining of colon tissue from IBD model group; D: HE staining of colon tissue from control group

圖3 移植后腸道內(nèi)BMSCs圖4 Y染色體PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig 3 BMSCs in colon after transplantationFig 4 Agarose gel electrophoresis of PCR Y chromosome products

綜上所述，BMSCs可作為細(xì)胞移植治療炎癥性腸病的一種細(xì)胞源選擇。然而，有關(guān)BMSCs如何發(fā)揮作用、是否可以在受體腸道組織內(nèi)長期存活并增殖分裂、是否定向分化為腸道干細(xì)胞、是否通過免疫及炎癥調(diào)節(jié)機(jī)制促進(jìn)腸道本身的干細(xì)胞定向分化、是否對IBD各個(gè)發(fā)病階段或其并發(fā)癥都發(fā)揮作用、以及植入后干細(xì)胞在體內(nèi)的最終命運(yùn)等等問題，還需要研究人員進(jìn)一步深入探討。

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