豬sall4b基因的克隆及表達分析

張鑫淼，韓小嬌，何文騰，劉世超，牟彥雙，胡魁，劉忠華

東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院 胚胎工程實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030

動物及獸醫(yī)生物技術

豬sall4b基因的克隆及表達分析

張鑫淼，韓小嬌，何文騰，劉世超，牟彥雙，胡魁，劉忠華

東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院 胚胎工程實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030

sall4基因是sall基因家族的一個成員，在胚胎發(fā)育、器官形成和干細胞多能性的維持以及重建中都起到重要作用，有sall4a和sall4b兩種剪切突變體類型。目前豬的sall4基因序列尚未獲得。鑒于其在多能性細胞調(diào)控中的作用，對豬的sall4基因進行了克隆測序，并對其在各組織及胚胎中的表達進行了初步研究。通過5￠和3￠RACE克隆得到豬sall4基因cDNA全長序列 (2 372 bp)，序列分析證明此基因編碼的蛋白結構更接近于小鼠和人Sall4B亞型，同源性可達70%～80%，而與其他物種的Sall4A相比則缺少一段含鋅指結構域的片段，同源性降至30%～55%。Real-time PCR證明豬sall4b基因廣泛表達于豬的各種器官，其中除卵巢組織呈高量表達之外，脾、肺、心和睪丸表達量也相對較高；在早期胚胎發(fā)育過程中除 4-細胞階段相對表達量較低，其他階段呈高量表達。免疫熒光跟蹤Sall4在豬早期胚胎中的表達情況發(fā)現(xiàn)Sall4在著床前胚胎中全程表達并定位于細胞核中，在囊胚階段基因表達趨向于定位在內(nèi)細胞團中。表達分析證明sall4b基因與多能性緊密相關，預示著豬sall4b基因將可能作為新的重編程因子用于誘導豬多能干細胞的體系中。

sall4，基因克隆，基因表達，胚胎，豬

Abstract:sall4, a member ofsall4gene family, plays important roles in embryo development; organogenesis as well as pluripotency maintenance and re-establishment. There are two isoforms of Sall4, Sall4A and Sall4B. The sequence of porcinesall4gene is still not reported. Because of its distinct role in maintaining the pluripotent state of stem cells, wecloned and sequenced porcinesall4gene and assessed its expression in pig tissues and embryos. One 2 372 bp nucleotide sequence representing the full-length cDNA of pigsall4was obtained by 5￠and 3￠RACE. Analyses of putative protein sequence showed a 70% to 80% identity with isoform Sall4B of human and mouse. Comparing with Sall4A, the identity reduced to 30% to 55% because of the loss of a zinc-finger domain-rich fragment. Assessment ofsall4bexpression in porcine tissues by Real-time PCR showed that it expressed most strongly in ovary and stronger in spleen, lung, heart and testis. For preimplantation embryos, the expression level was lower in 4-cell embryos compared with other stages.Immuno-fluorescence analysis of Sall4 on porcine preimplantation embryos indicated that it expressed in all the preimplantation embryos and located in nucleus, in blastocyst it preferentially limited in ICM cells. Expression pattern in early embryos suggest that pigsall4bis associated with pluripotency and might be a new and useful reprogramming factor for establishing pig induced pluripotent stem cell lines.

Keywords:sall4, gene cloning, gene expression, embryo, pig

sall4屬于婆羅雙樹樣基因 (splat-like/sall)家族成員，最初在研究人類常染色體顯性遺傳病Okihiro綜合征時被發(fā)現(xiàn)并鑒定。sall4基因突變導致四肢畸形、眼球運動缺陷、直腸、耳、心和腎的發(fā)育異常[1-2]，而在小鼠中雙敲除sall4基因則直接導致植入初期胚胎致死[3-4]，證明sall4基因對于早期胚胎發(fā)育是不可或缺的。sall4基因缺失的小鼠胚胎難以建立胚胎干細胞系[3,5]，在細胞融合[6]和多能因子[5]介導的重編程中都證明了高量表達sall4基因能夠提高重編程效率，說明sall4對多能性的維持及重建都起到關鍵作用。最近在人[7]和小鼠[8]中發(fā)現(xiàn)sall4基因由于選擇性剪切可以形成兩種不同的剪切突變體sall4a和sall4b。與sall4a相比，sall4b缺失了第二外顯子的大部分區(qū)域，在小鼠胚胎干細胞中更趨于高表達。當只表達一種亞型時，sall4b單獨即可維持干細胞的多能性狀態(tài)[8]，提示sall4b可作為建立誘導多能性干細胞(Induced pluripotent stem cells，iPS cells) 的重要誘導因子。

雖然sall4b基因的結構和功能在小鼠和人上得到初步的研究，但在其他物種中還并沒有獲得同樣的剪切變異體。豬作為一種重要的動物模型，在代謝和器官大小方面都與人有極高的相似性，具有很高的研究價值[9-11]。多能性干細胞是疾病模型建立、疾病機理研究和醫(yī)學再生領域的重要的實驗材料。但是目前為止，尚未建立真正具有形成嵌合體能力的豬胚胎干細胞。自 2009年以來，先后有幾個研究組報道了豬iPS細胞的建立[12-15]，但目前為止只有一個研究組初步證明了他們建立的iPS細胞系可能具有形成嵌合體的能力[16]。其中一個重要的原因可能是目前適用于小鼠和人的重編程因子組合并不足以完全重編程豬的分化細胞至多能性干細胞狀態(tài)。豬sall4b基因的克隆對完全重編程iPS細胞系的建立和多能性維持機制的研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

新生大白仔豬購買于哈爾濱市三原種豬場，在實驗室解剖取材，將取得的各器官組織樣 (包括腎、腸、脾、胃、肺、肝、腦、心肌、骨骼肌、睪丸、脂肪、卵巢) 保存于液氮中。用于克隆基因的卵巢組織來自于當?shù)赝涝讏?，收集后盡快保存于液氮中，用于提取RNA。

1.2 主要試劑

TRIzol試劑盒購自Invitrogen公司；PCR試劑盒、SYBR熒光實時定量 PCR試劑盒、pMD18-T載體均購自TaKaRa公司；瓊脂糖粉劑購自 Amresco公司；反轉試劑盒購自ABI公司和TaKaRa公司；免疫熒光抗體一抗購自GeneTex公司，二抗購自Santa Cruz公司。

1.3 RNA提取與反轉cDNA

用 TRIzol試劑將性成熟豬卵巢按照標準方案提取 RNA，并溶解于DEPC處理水中，以此為模板用反轉錄試劑盒 (ABI) 反轉錄為cDNA。新生豬各組織用同樣方法獲得 RNA，反轉為cDNA時使用 TaKaRa公司反轉試劑盒，用于Real-time檢測。引物序列具體見表2。

1.4 PCR 擴增與 5￠ RACR 與 3￠ RACE

反應體系25 μL∶1 μL模板cDNA，上下游引物混合物 1 μL (濃度各為 10 μmol/L)，dNTPs 2.5 μL，Pfu酶 0.2 μL，10×緩沖液 2.5 μL 溶解于17.8 μL滅菌去離子水中。引物序列與反應條件詳見表 1。5￠RACR 與 3￠RACE 用于獲得sall4bmRAN全長，按照TaKaRa公司試劑盒說明書標準操作。

1.5 序列分析、比對分析與系統(tǒng)樹分析

開放讀碼框分析使用NCBI工具ORF finder(www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/)并翻譯為相應的氨基酸序列。蛋白結構域分析使用 SMRAT(http://smart.embl-heidelberg.de/)與NCBI CDD數(shù)據(jù)庫 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)，序列比對使用ClustalX2軟件，比對序列由 NCBI數(shù)據(jù)庫提供。系統(tǒng)樹分析采用MEGA5.1軟件進行。理論PI值和預測分子量使用 Prot-Param工具(http://kr.expasy.org/tools/protparam.html)。

1.6 IVF胚胎的獲取

從哈爾濱市三原種豬場人工采集大白種公豬新鮮精液，回到實驗室后離心棄除精清，用DPBS懸浮，1 000 r/min離心洗滌精子，棄上清再懸浮，重復3次，最后用預先平衡的受精液懸浮，調(diào)節(jié)精子濃度到1.0×106個/mL。同時預先在成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)42 h的卵母細胞移至30 μL受精液微滴中，將20 μL受精液與30 μL預先成熟培養(yǎng) 42 h的卵母細胞以卵母細胞數(shù)：精子數(shù)=1∶200的比例混合，12 h后換為胚胎培養(yǎng)液，取不同發(fā)育階段胚胎進行Real-time PCR及免疫熒光實驗。

1.7 SYBR實時定量PCR測定

反應體系為25 μL，上、下游引物各0. 5 μL，SYBR Mix 12.5 μL，ddH2O 10.5 μL，cDNA 1 μL。循環(huán)參數(shù)：94 ℃ 5 min ；94 ℃30s，60 ℃30s，72 ℃30s，85 ℃8 s收集熒光，40個循環(huán)。以18S rRNA作為內(nèi)參對照，引物序列具體見表2。

1.8 免疫熒光

各階段IVF胚胎在四孔板中進行固定，預冷的4%的多聚甲醛固定30 min；透膜液37 ℃恒溫孵育1 h；封閉液37 ℃封閉1 h；移入一抗中(稀釋比例為 1∶200) 4 ℃孵育過夜；清洗清洗5 min，連續(xù) 3次；移入二抗 (鼠抗兔稀釋比例為1∶200) 37 ℃孵育1 h；清洗5 min，連續(xù)3次；Hoechst染核10 min，清洗液清洗；移至涂有防淬滅劑的載玻片上，壓片，熒光顯微鏡下觀察。

1.9 統(tǒng)計學分析

Real-time PCR結果分析方法采用經(jīng)典的2△△Ct法，基因的表達水平經(jīng)過 SAS軟件的ANOVA檢驗，P＜0.05判定為差異顯著。

2 結果與分析

2.1sall4b基因的克隆

假設豬sall4基因也存在兩種剪切突變體，首先選擇由基因組測序得到的豬sall4編碼區(qū)預測序列NM_001114673.1作為sall4a模板，另外通過與小鼠和人的sall4b編碼區(qū)比對自行預測了豬sall4b的編碼區(qū)序列。為了鑒定兩種剪切突變體是否存在，我們在預測選擇性剪切位點兩端跨位點設計上下游引物。以豬卵巢 cDNA為模板，PCR擴增僅得到一條與預測sall4b符合的1 062 bp條帶 (圖1A)，測序結果證明可與sall4b預測序列匹配。為了獲得sall4基因mRNA的全長序列，在已得序列的基礎上進行 5￠與3￠ RACE 實驗，5￠ RACE 的 GSP 引物設計在選擇性剪切位點的下游，以期通過RACE實驗進一步鑒定sall4a的存在，但仍然僅得到一條與sall4b預測長度匹配的1 500 bp特異性條帶 (圖1B)。3￠ RACE實驗得到一條841 bp的特異性條帶產(chǎn)物(圖1C)。經(jīng)測序分析，分別與已得的1 062 bp的中段序列有 988 bp和 43 bp的重合，證明RACE擴增得到的是特異性條帶。為了得到mRNA全長序列，我們將三段序列用重疊PCR的方式連接起來，中間的保守序列首先與 3￠端連接得到1 860 bp片段 (圖1D)，此PCR產(chǎn)物再與5￠ RACE PCR產(chǎn)物進行第二輪重疊PCR獲得2 372 bp mRNA全長 (圖1E)。我們設計了針對于預測sall4a的特異性鑒定引物，仍沒有獲得相應條帶。

圖1 克隆豬sall4b基因Fig.1 Molecular cloning of pigsall4b.M: DNA marker; 1: PCR product for middle part; 2: 3￠ RACE PCR product; 3:5￠ RACE PCR product; 4: overlap PCR product of middle part and 3￠ RACE PCR product; 5: full-length ofsall4mRNA.

所獲得的含有完整編碼區(qū)的 cDNA序列經(jīng)NCBI工具ORF finder分析，找到1 851 bp的編碼區(qū)，編碼616 aa的多肽鏈。經(jīng)SMART工具分析蛋白含有3個ZnF_C2H2鋅指結構域 (分別在72-92 aa，432-454 aa和460-482 aa位置)。序列已提交至 GenBank (GenBank Accession No.JQ773336)，序列見圖2。

圖2 豬sall4b核酸序列及預測蛋白序列Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of pigsall4b. The ORF is presented above the amino acid sequences.

2.2sall4基因同源性分析

將克隆序列測序后得到的sall4核酸序列翻譯為蛋白序列，并與其他物種的Sall4蛋白序列進行比對，兩兩比對相似性結果如表1所示，發(fā)現(xiàn)我們克隆得到的sall4基因與B類亞型匹配度更高。通過比較保守結構域，也確認豬 Sall4B蛋白與小鼠和人的 Sall4兩種亞型相比，豬Sall4B蛋白結構更接近于小鼠和人的Sall4B，相比與 Sall4A，缺少 2個富含鋅指的結構域(圖3)。因此我們將克隆的豬sall4基因命名為豬sall4b。

2.3sall4基因系統(tǒng)樹分析

為了闡述豬sall4b基因及其他物種的sall4基因的分子進化關系，我們基于氨基酸序列使用鄰接法構建系統(tǒng)樹。分析發(fā)現(xiàn)整個進化樹可以分為兩個主支：哺乳動物類和非哺乳動物，前者有可分為明顯的3個分支：靈長類、偶蹄類和嚙齒類。整個系統(tǒng)樹的分析結果基本符合常規(guī)分類學。雖然亞型不同，但Sall4A與Sall4B在物種內(nèi)是同源的 (圖 4)。

表1 豬Sall4蛋白序列與其他物種Sall4蛋白序列對比相似性Table 1 Sall4 identities between pig and other organisms

圖3 豬、小鼠和人Sall4蛋白保守結構域的比對Fig.3 Alignment of conserved domain of pig, human and mouse Sall4.

2.4sall4基因定量及定位表達分析

在新生豬各個組織器官和豬早期胚胎的各個發(fā)育階段中檢測sall4基因表達情況如圖 5所示。Real-time PCR結果證明sall4b基因在各個組織中均有表達，除卵巢組織表達非常強烈之外，脾、肺、心和睪丸相對表達量較高，而在豬 IVF早期胚胎發(fā)育過程中跟蹤檢測中發(fā)現(xiàn)，相對于合子階段胚胎，4-細胞階段胚胎相對表達量較低，而至8-細胞至囊胚階段表達量逐漸升高。免疫熒光實驗證明 Sall4蛋白定位于細胞核內(nèi)，在各個發(fā)育階段均有表達，并且隨著發(fā)育進行內(nèi)細胞團與滋養(yǎng)外胚層的表達量出現(xiàn)了差異，Sall4蛋白逐漸限定于內(nèi)細胞團中表達。

圖4 系統(tǒng)樹分析Fig.4 Phylogenic tree analysis.

圖5sall4b基因在組織和胚胎中的表達情況Fig.5sall4bexpression in tissues and embryos.

表2 引物序列與PCR條件Table 2 Primers and PCR conditions

3 討論

在本實驗中我們獲得了豬sall4基因的mRNA全長序列，經(jīng)結構分析并與其他物種的Sall4蛋白亞型的序列比對發(fā)現(xiàn)，獲得的基因編碼的蛋白與小鼠和人 Sall4B匹配，而與小鼠Sall4A蛋白序列相比則缺少一段鋅指結構富集區(qū)。我們在從豬卵巢組織中克隆sall4基因時并沒有獲得與小鼠和人sall4a相匹配的轉錄變異體，利用針對于sall4a特異序列設計的鑒定引物在檢測的各組織中也并沒有擴增出相應 PCR產(chǎn)物。有可能是由于檢測的各組織中sall4a的表達量較低，或者在豬中并不存在sall4a型的轉錄變異體。Sall4A和Sall4B兩種亞型結構的差異決定了兩者結合DNA和其他蛋白的位點可能有所不同，在小鼠sall4b的研究中也證明了在整個基因組中sall4a與sall4b的靶位點有交叉，但不完全相同[8]。而豬sall4b特異性的表達模式，可能是豬與小鼠和人在早期胚胎發(fā)育和多能性維持機制的差異形成的重要原因之一。例如，與小鼠和人的胚胎中oct4基因限定在內(nèi)細胞團中的表達模式不同，豬早期胚胎中oct4基因在滋養(yǎng)外胚層中也有所表達，小鼠中的研究已經(jīng)證明sall4與oct4互相激活形成正反饋機制[17]，在豬中sall4a亞型的低表達或缺失可能是豬oct4基因特異性表達模式的原因之一。因此，比較小鼠和人與豬sall4基因靶位點的差異可能對于揭示小鼠和人與豬早期胚胎及多能性維持機制的差異具有重要意義。

由于并沒有檢測到sall4a的表達，因此本實驗體系驗證下的sall4基因Real-time檢測結果可以認為即是sall4b的檢測結果。表達分析證明各種組織中均有所表達，但在卵巢中表達尤其高，另外脾、肺、心和睪丸也相對表達量較高。這一結果與在人sall4b的研究一致[7]。sall4b基因在這些組織中的高量表達提示了sall4b可能參與這些組織的發(fā)育及功能維持等。在人的研究中發(fā)現(xiàn)sall4的突變可導致卵巢早衰[18]，而sall4b在豬卵巢中相對于其他組織和胚胎的極高量表達可能預示著sall4b對豬卵巢發(fā)育及功能維持具有重要作用。卵母細胞質(zhì)量是影響核移植重編程最重要的因素，結合sall4b在豬受精卵中的表達情況，猜測sall4b的高量表達可能有助于提高豬核移植效率。另外有文章證明sall4作為原癌基因可能是睪丸[19]和肺[20]腫瘤形成主要誘導因素之一，提示豬sall4b基因可能對睪丸和肺中某種或某些細胞的增殖能力及發(fā)育具有調(diào)控作用。另外sall4基因在血細胞生成以及造血干細胞多能性的維持上具有重要作用[21-22]，而我們檢測的組織來自于新生豬，新生豬脾可能還具有殘留的部分造血功能，因此這些組織表達sall4b的含量較高。在豬早期胚胎的跟蹤實驗中證明sall4b基因表達及定位隨著發(fā)育而有所變化。在受精卵中，sall4b的表達量高于2細胞及4細胞階段，可能在合子基因啟動之前，母源sall4bmRNA是主要來源。而到桑葚胚至囊胚階段，sall4基因表達量逐漸上升，并且趨于表達限制在內(nèi)細胞團中。說明與小鼠和人一致，豬sall4b基因與多能性也具有緊密相關性。

綜上所述，我們首次克隆了豬sall4b基因，并用實驗方法證明了除小鼠和人之外在其他哺乳動物中sall4b型剪切形式。初步獲得了豬sall4b基因的表達模式，表達分析證明sall4b基因與多能性緊密相關，預示著sall4b基因將有可能作為新的重編程因子應用于豬多能性細胞的誘導體系中。

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Cloning and gene expression ofsall4bgene in pig

Xinmiao Zhang, Xiaojiao Han, Wenteng He, Shichao Liu, Yanshuang Mu, Kui Hu,and Zhonghua Liu

Laboratory of Embryo Engineering,Department of Life Science,Northeast Agricultural University,Harbin150030,Heilongjiang,China

張鑫淼, 韓小嬌, 何文騰, 等. 豬sall4b基因的克隆及表達分析. 生物工程學報, 2012, 28(10): 1164?1174.

Zhang XM, Han XJ, He WT, et al. Cloning and gene expression ofsall4bgene in pig. Chin J Biotech, 2012, 28(10): 1164?1174.

Received:March 16, 2012;Accepted:June 7, 2012

Supported by:National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2009CB941002).

Corresponding author:Zhonghua Liu. Tel/Fax: +86-451-55191747; E-mail: liu086@yahoo.com

國家重點基礎研究發(fā)展計劃(973計劃) (No. 2009CB941002)資助。