重組nkx2.5腺病毒抑制過氧化氫誘導的H9c2細胞凋亡

李濤，姜科聲，阮琴，劉志強

1 浙江師范大學 化學與生命科學學院，浙江 金華 321004

2 浙江師范大學 行知學院，浙江 金華 321004

3 Department of Lymphoma and Myeloma, Division of Cancer Medicine, Center for Cancer Immunology Research, the University of Texas M. D. Anderson Cancer Center, Houston, Texas 77030, USA

生物技術(shù)與方法

重組nkx2.5腺病毒抑制過氧化氫誘導的H9c2細胞凋亡

李濤1，姜科聲1，阮琴2，劉志強3

1 浙江師范大學 化學與生命科學學院，浙江 金華 321004

2 浙江師范大學 行知學院，浙江 金華 321004

3 Department of Lymphoma and Myeloma, Division of Cancer Medicine, Center for Cancer Immunology Research, the University of Texas M. D. Anderson Cancer Center, Houston, Texas 77030, USA

為研究心臟發(fā)育關(guān)鍵基因nkx2.5的功能及應用價值，構(gòu)建Ad-Nkx2.5重組腺病毒，并檢測nkx2.5過表達拮抗氧化應激損傷的效應及機制。采用AdEasy 腺病毒表達系統(tǒng)構(gòu)建Ad-Nkx2.5重組腺病毒，建立H2O2誘導H9c2心肌細胞凋亡模型，分別用Ad-Nkx2.5重組病毒或?qū)φ詹《靖腥炯毎?，采用Hoechst33342染色觀察細胞形態(tài)變化、MTT法檢測細胞存活率，免疫印跡檢測caspase-3活化、細胞色素C的胞漿含量。并通過Real-time PCR檢測凋亡相關(guān)基因bcl-2和bax表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，nkx2.5過表達促進 H9c2細胞存活，抑制 H2O2誘導的caspase-3活化及線粒體細胞色素C的釋放。Nkx2.5過表達上調(diào)bcl-2表達，顯著下調(diào)H2O2誘導的bax表達。并發(fā)現(xiàn)H2O2對Nkx2.5核定位無明顯影響。結(jié)果顯示重組腺病毒介導的Nkx2.5過表達可通過調(diào)控凋亡相關(guān)基因表達，抑制線粒體凋亡途徑，保護心肌細胞抗氧化損傷。

Nkx2.5，重組腺病毒，過氧化氫，氧化應激，H9c2細胞，凋亡

Abstract:To study the function and potential application ofnkx2.5, a critical gene for heart development, we constructed a recombinant adenovirus overexpressingnkx2.5gene (Ad-Nkx2.5) with the AdEasy system. To evaluate the effect and mechanism of Ad-Nkx2.5 against oxidative injury, the H9c2 myocardial cells were infected with the recombinant adenoviruses Ad-Nkx2.5 or Ad-EGFP, and subsequently exposed to H2O2to induce apoptosis. The anti-apoptotic potential of Ad-Nkx2.5 was validated by MTT assay for cell viability, Hoechst33342 staining for cellular morphology, and immunoblotting for caspase-3 activity. Ad-Nkx2.5 infection led to an increased survival rate of H9c2 cells and decreased the amount of caspase-3 in an active form. Additionally, overexpression ofNkx2.5inhibited the release of cytochrome C from the mitochondria into the cytosol. Mechanismic studies showed that Nkx2.5 upregulatedbcl-2gene expression and significantly repressed H2O2-induced expression ofbaxdetected by Real-time PCR. Additionally, H2O2treatment did not affect the nuclear localization of Nkx2.5. These findings indicate that adenovirus-mediatednkx2.5gene transfer exerted a protective effect on H9c2 cells against H2O2-induced apoptosis via mitochondrial pathway, and the Nkx2.5-mediated expression modulation of apoptosis-associated genes could be involved in this event.

Keywords:Nkx2.5, recombinant adenovirus, hydrogen peroxide, oxidative stress, H9c2 cells, apoptosis

轉(zhuǎn)錄因子 Nkx2.5是關(guān)鍵的心肌發(fā)育調(diào)控因子，能夠激活大量心肌特異性功能基因表達，參與心臟前體細胞的分化增殖、心臟的環(huán)化、房室分隔、房室流出道和傳導系統(tǒng)的形成及成熟心臟正常功能的維持[1-2]。nkx2.5突變或表達異常將導致嚴重的心臟發(fā)育異常[3]。Nkx2.5另一重要功能為維持心肌細胞存活，抗缺血及凋亡[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)野生型nkx2.5能夠穩(wěn)定乳鼠心肌細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)、拮抗過氧化氫和阿霉素引發(fā)的凋亡。當注射阿霉素以后，失活型nkx2.5的轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)嚴重的心臟功能異常，發(fā)生凋亡的心肌細胞明顯增多；野生型nkx2.5基因轉(zhuǎn)染后，能減輕阿霉素誘導的心肌損傷。

心肌缺血及再灌注過程中會產(chǎn)生大量氧自由基，造成心肌不可逆性的凋亡或壞死，并進一步演化為心力衰竭[7]。目前，正在探索通過干細胞移植治療梗死性心臟病[8]。體外干細胞轉(zhuǎn)入nkx2.5基因不僅有利于其特異性的向心肌誘導分化，也有利于提高移植細胞的存活率，改善心肌細胞功能[6]。nkx2.5有望成為心肌梗死等疾病的基因治療分子。

但是 Nkx2.5拮抗心肌細胞凋亡的機制依然并不十分明確。本課題通過構(gòu)建Nkx2.5過表達的重組腺病毒，包裝病毒感染H9c2大鼠心肌細胞，并通過過氧化氫誘導凋亡模型，進一步研究闡釋Nkx2.5拮抗心肌凋亡的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

pFLAG-Nkx2.5質(zhì)粒由 Harvey RP教授(Victor Chang Cardiac Research Institute，Sydney，Australia) 惠贈。腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrackcmv、骨架質(zhì)粒pAdEasy-1、JM109及BJ5183菌、HeLa及H9c2細胞均為本實驗室保存。PmeⅠ及PacⅠ(NEB)，Lipofectamine 2000 (Invitrogen)，質(zhì)粒大量提取試劑盒 (Vigorous)。MMLV反轉(zhuǎn)錄酶、T4 DNA連接酶、T4多聚核苷酸激酶 (PNK) 均購自Promega公司；TaqDNA聚合酶和限制性內(nèi)切酶購自New England Biolabs公司；蛋白酶K和DNA marker購自北京 TIANGEN公司；Hoechst33342和 G418購自 Sigma公司。抗Nkx2.5、細胞色素 C、GAPDH抗體購自 Santa Cruz公司，抗caspase-3抗體購自Cell signaling公司。[γ-32P] ATP購自北京亞輝生物醫(yī)學工程公司。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建及腺病毒包裝鑒定

腺病毒質(zhì)粒構(gòu)建及包裝方法按文獻報道[9]。將 pFLAG-Nkx2.5和腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdtrackcmv用BglⅡ和SalⅠ進行大量雙酶切，建立Nkx2.5、pAdtrackcmv定向連接反應體系。重組pAdtractcmv-Nkx2.5質(zhì)粒經(jīng)PmeⅠ線性化后熱休克轉(zhuǎn)化含腺病毒骨架質(zhì)粒 pAdEasy-1的BJ5183感受態(tài)菌進行同源重組、卡那霉素篩選。經(jīng)PacⅠ酶切鑒定正確重組的 pAd-Nkx2.5腺病毒質(zhì)粒。pAd-Nkx2.5質(zhì)粒DNA經(jīng)PacⅠ酶切線性化后，按照Lipofectamine 2000說明書，轉(zhuǎn)入293A細胞中進行病毒包裝，倒置熒光顯微鏡下觀察病毒噬斑的變化。待14 d后所有細胞感染病毒，變圓漂浮后，離心收集細胞，PBS漂洗后液氮反復凍融細胞3次，1000 r/min離心10 min后收集上清。倍比稀釋后感染293A細胞，24 h后熒光顯微鏡觀察，按公式：發(fā)熒光細胞數(shù)×稀釋度/病毒液體積計算病毒滴度。對照空病毒為既往保存。

采用PCR法構(gòu)建pEGFP-Nkx2.5質(zhì)粒，使用引物如下：forward primer: 5￠-GCCGAATTC ATG TTCCCCAGCCCTG-3￠，reverse primer: 5￠-TAGG ATCC CAGGCTCGGATGCCGTGC-3￠。擴增片段插入pEGFP-N1質(zhì)粒，測序正確后大提純化。瞬轉(zhuǎn)H9c2細胞后，加入G418 (400 mg/L) 篩選穩(wěn)定克隆。

1.3 Western blotting檢測蛋白表達

HeLa細胞或H9c2細胞接種于6孔板上，培養(yǎng)過夜后分別加入不同感染復數(shù) (Multiplicity of infection，MOI) 的病毒液。經(jīng)不同處理后棄培養(yǎng)液，提取蛋白，BCA法蛋白定量。30 μg蛋白煮沸后，12% SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h后加入抗Nkx2.5、caspase-3、細胞色素C (Cytochrome C) 或GAPDH抗體進行雜交，漂洗后辣根過氧化物酶標記的二抗孵育，化學發(fā)光法進行顯色反應。

1.4 凝膠阻滯 (EMSA) 檢測Nkx2.5表達

按文獻方法提取HeLa細胞核蛋白，建立體外反應體系[10]。北京奧科公司合成Nkx2.5特異識別的雙鏈探針，正鏈序列如下：5￠-TCTTCTCA CACCTTTGAAGTG GGGGCCTCT-3￠。T4 多聚核苷酸激酶對探針進行末端32P標記。在每組反應混合物中，核蛋白用量為10 μg，用6%的非變性PAGE膠電泳，放射自顯影顯示Nkx2.5蛋白與探針DNA結(jié)合條帶。

1.5 噻唑藍 (MTT) 法檢測H9c2相對活力

將H9c2細胞以1×105/孔接種至96孔板，以含100 mL/L胎牛血清，100 U/mL氨芐青霉素和100 mg/L鏈霉素的改良DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。加入不同MOI的重組病毒感染細胞，24 h后加入H2O2至終濃度為200 μmol/L誘導細胞，于作用后 0、1、2、3、4、6、8、10和 12 h加入 10% 5 g/L MTT。37 ℃孵育4 h后，終止培養(yǎng)，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150 μL DMSO，低速振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處測量各孔吸光值 (OD)。按下列公式計算細胞存活率：細胞存活率 (%) = H2O2處理組OD值/非處理組OD值×100%。每組設4個復孔，實驗重復3次。H2O2處理組與對照組相比，用配對t檢驗進行統(tǒng)計分析。

1.6 Hoechst33342染色及熒光觀察

H9c2細胞加入終濃度為 1 mg/L的Hoechst33342避光染色30 min，PBS漂洗3次，細胞繼續(xù)培養(yǎng)并進行下一步H2O2處理。H2O2處理6 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察各組細胞核形態(tài)變化，并結(jié)合EGFP染色觀察細胞形態(tài)變化，拍照。

1.7 DNA ladder法檢測DNA片段化

參照文獻進行[11]，簡述如下。1×107個H9c2細胞接種至培養(yǎng)皿中，以200 μmol/L H2O2誘導細胞。作用12 h收集全部細胞 (貼壁和非貼壁)，以細胞裂解液裂解細胞。0.1 g/L RNase A 37 ℃孵育1 h，0.2 g/L蛋白酶K 56 ℃孵育3 h。以酚/氯仿法抽提基因組DNA后溶解于TE緩沖液中，1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

1.8 線粒體提取與細胞色素C檢測

線粒體提取采用 Pierce公司試劑盒(Mitochondria Isolation Kit for Cultured Cells，89874)，簡述如下。H9c2細胞(1×107) 經(jīng)200 μmol/L H2O2處理6 h后，離心收集所有細胞。加入400 μL buffer A，渦旋振蕩5 s，冰浴2 min，加入 5 μL buffer B 振蕩，冰浴 5 min。加入 400 μL buffer C顛倒混勻，700×g低溫離心10 min，取上清。12 000×g低溫離心15 min，取上清即為胞漿蛋白。再將沉淀加入250 μL緩沖液C漂洗，12 000×g離心5 min，取沉淀即為線粒體，沉淀加入蛋白裂解液裂解得線粒體蛋白。BCA法測定各組分的蛋白濃度，Western blotting檢測細胞色素c的含量。

1.9 Real-time PCR及RT-PCR

參照文獻進行Real-time PCR[12]。H9c2細胞經(jīng)200 μmol/L H2O2處理6 h后，收集所有細胞。按Trizol法提取細胞總RNA，隨機引物法逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA第一條鏈。采用 TOYOBO公司的SYBR Green Real-time PCR Master Mix在ABI7700型定量PCR儀上進行PCR反應。測定樣品的Ct值 (Cycle threshold，循環(huán)閾值) 通過計算 2-△△Ct來比較不同樣品之間特定基因的表達差異。每個樣本組均設定3個平行復孔，實驗至少重復3次，以平均值±標準差的形式在柱狀圖中顯示。RT-PCR在 T-gradientTMPCR儀(Biometra) 進行，引物退火溫度為 58 ℃，循環(huán)數(shù)25～30。用于Real-time PCR及RT-PCR的引物序列見表1。

表1 Real-time PCR及RT-PCR使用引物Table 1 Primer sequences for Real-time PCR and RT-PCR

1.10 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)以均值±標準差表示，采用 SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗和單因素方差分析。P<0.05表示有顯著性差異，P<0.01表示有非常顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組Nkx2.5腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

pFLAG-Nkx2.5質(zhì)粒經(jīng)BglⅡ和SalⅠ雙酶切后，釋放約1.1 kb的nkx2.5表達片段，再連入雙酶切的pAdtrackcmv骨架質(zhì)粒，克隆成功后酶切鑒定結(jié)果如圖1A所示。pAdtrackcmv-Nkx2.5質(zhì)粒經(jīng)PmeI線性化，轉(zhuǎn)入事先轉(zhuǎn)入腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的BJ5183菌，進行同源重組，經(jīng)卡那霉素篩選，重組克隆經(jīng)PacI酶切鑒定。正確重組的質(zhì)粒約33 kb，可切出約30 kb的片段及一個3.0或4.5 kb大小的片段。結(jié)果如圖1B所示，可以發(fā)現(xiàn)重組體可切出一個4.5 kb大小的片段，pAd-Nkx2.5重組成功。

圖1 pAd-Nkx2.5質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定Fig.1 Construction and identification of pAd-Nkx2.5 plasmid. (A) Identification of pAdtrackcmv-Nkx2.5 plasmid byBglⅡandSalI digestion. (B) Identification of pAd-Nkx2.5 plasmid byPacI digestion.

2.2 重組Nkx2.5腺病毒的包裝及鑒定

將經(jīng)過PacI線性化的pAd-Nkx2.5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293A細胞進行包裝。熒光顯微鏡觀察病毒噬斑，2 d起逐步出現(xiàn)噬斑，14 d左右有大量的病毒噬斑形成 (圖 2A)，細胞大量表達 EGFP，形態(tài)變圓并且呈漂浮狀態(tài)。收獲細胞裂解釋放病毒，倍比稀釋法測定病毒滴度，重組Ad-Nkx2.5滴度為5×1011efu/mL (efu：expression-forming units)。按MOI=100感染 HeLa細胞。并提取 RNA進行RT-PCR檢測nkx2.5表達，并通過Western blotting檢測蛋白表達。結(jié)果如圖 2B和 C所示，感染Ad-Nkx2.5的 HeLa細胞存在 Nkx2.5的 mRNA及蛋白表達，而感染對照病毒的細胞未檢測到Nkx2.5表達。為了鑒定腺病毒載體表達的Nkx2.5蛋白是否具備完整的蛋白功能，又進行了EMSA實驗。通過合成 Nkx2.5特異結(jié)合的 DNA探針(含保守結(jié)合序列TNNAGTG)，體外同位素標記后與感染病毒后提前的細胞核蛋白孵育，非變性PAGE分離后壓片曝光。結(jié)果如圖2D所示，感染 Ad-Nkx2.5的 HeLa細胞核蛋白能夠與 DNA探針結(jié)合，而對照病毒組無特異條帶。這表明重組腺病毒所表達的Nkx2.5蛋白具有正常的DNA結(jié)合能力。

2.3 Nkx2.5過表達保護H9c2細胞抗氧化損傷

Nkx2.5是重要的心肌調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子。為了進一步研究 Nkx2.5的分子功能，我們運用Ad-Nkx2.5腺病毒感染大鼠心肌細胞系H9c2細胞，檢測nkx2.5過表達對H9c2細胞凋亡的影響。H9c2細胞是來源于大鼠心室肌的心肌細胞系，在 H2O2等氧化刺激下能表現(xiàn)出典型的凋亡特征。H9c2細胞分別感染不同滴度Nkx2.5腺病毒(MOI分別為 0、25、50、100)，200 μmol/L H2O2處理細胞后通過MTT法檢測細胞活力。結(jié)果顯示如圖3A所示，隨著Nkx2.5腺病毒滴度增高，顯著提高了細胞存活率。其中H2O2誘導12 h后，Ad-Nkx2.5最高劑量組 (MOI=100) 細胞損失率為 24.6%，Ad-Nkx2.5最低劑量組 (MOI=0) 細胞損失率則達 83.9% (P<0.01，n=4)。因此，后續(xù)實驗均選擇MOI=100的Ad-Nkx2.5病毒作為感染濃度。并以Ad-EGFP感染組為對照，其H2O2誘導12 h后細胞存活率為21.3%，而Ad-Nkx2.5組細胞存活率為72.9% (P<0.01，n=4) (圖3B)。結(jié)果提示Nkx2.5過表達可以保護H9c2細胞拮抗H2O2誘導的氧化損傷。

圖2 重組Nkx2.5腺病毒的包裝及鑒定Fig.2 Packaging and identification of recombinant adenovirus overexpressing Nkx2.5. (A) Adenovirus plaque was monitored by fluorescence microscopy (100×). (B, C) Identification of Nkx2.5 expression in HeLa cells by RT-PCR (B)and Western blotting (C). (D) Overexpressed Nkx2.5 from HeLa cells infected with Ad-Nkx2.5 bound with specifec DNA probes in EMSA assay.

圖3 Nkx2.5過表達保護H9c2細胞抗氧化損傷Fig.3 Overexpression of Nkx2.5 protects H9c2 cells against H2O2-induced oxidative injury. (A) H9c2 cell viability was evaluated by MTT assay after Ad-Nkx2.5 infection and subsequently H2O2(200 μmol/L) treatment. (B)Comparisons of cell viability between Ad-Nkx2.5 and Ad-EGFP groups. (C) Morphological changes were examined in H9c2 cells treated with H2O2(200 μmol/L) for 6 h. Arrows indicated typical apoptotic change, including cell shrinkage,blebbing, nuclear condensation and fragmentation (400×).

Ad-Easy腺病毒系統(tǒng)自帶EGFP基因，細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)會被綠色熒光顯色，同時采用Hoechest33342對細胞核熒光染色，即可對細胞凋亡時形態(tài)變化進行檢測。結(jié)果可見，Ad-EGFP感染組在H2O2處理6 h后，即出現(xiàn)典型的凋亡表現(xiàn)：細胞皺縮變圓，細胞間連接消失，部分細胞發(fā)生脫落飄浮，細胞表面出現(xiàn)發(fā)芽起泡等形式的球形突起 (即凋亡小體)，核皺縮變小，密度增加，并發(fā)生濃縮碎裂 (圖 3C)。隨著時間推延，綠色熒光逐步消失，細胞崩解。而Ad-Nkx2.5感染組細胞形態(tài)及核形態(tài)大部分呈現(xiàn)正常狀態(tài)，說明Nkx2.5過表達可抑制 H2O2誘導的 H9c2細胞凋亡。

2.4 Nkx2.5過表達拮抗線粒體凋亡途徑

細胞凋亡有3種途徑：線粒體途徑，死亡受體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。一般認為 H2O2所介導的氧化損傷激活線粒體凋亡途徑。我們進一步驗證Ad-Nkx2.5腺病毒感染拮抗H2O2所介導的H9c2細胞凋亡的相關(guān)機制。利用DNA ladder實驗分析發(fā)現(xiàn)，H2O2誘導對照組細胞發(fā)生DNA片段化降解，形成以單個核小體和寡聚核小體為基礎的梯形DNA條帶，間距大小約為180～200 bp，為典型的凋亡特征 (圖4A)。而感染Ad-Nkx2.5腺病毒的細胞未發(fā)現(xiàn)明顯DNA ladder條帶，表明Nkx2.5能夠抑制 H2O2誘導細胞凋亡 (圖 4A)。caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，無活性的procaspase-3以酶原 (32 kDa) 的形式存在于胞漿中，凋亡時切割為分子量分別為17 kDa和12 kDa的亞基而活化，進一步切割多聚 ADP-核糖聚合酶等底物蛋白。通過 Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，Ad-Nkx2.5腺病毒感染拮抗H2O2所介導caspase-3剪切活化 (圖4B)。為了判斷Ad-Nkx2.5腺病毒能否抑制線粒體途徑介導的凋亡，我們分別提取胞漿和線粒體蛋白進行Western blotting檢測。結(jié)果如圖4C所示，H2O2誘導對照組細胞線粒體功能障礙，細胞色素C由線粒體釋放進入胞漿，而 Nkx2.5的過表達則穩(wěn)定了線粒體功能，抑制細胞色素C釋放。這些實驗證據(jù)表明 Nkx2.5的過表達能夠抑制線粒體途徑介導的凋亡。

圖4 Nkx2.5過表達抑制線粒體途徑介導的H9c2細胞凋亡Fig.4 Overexpression of Nkx2.5 inhibits mitochondria-dependent apoptosis in H9c2 cells. (A) Overexpression of Nkx2.5 inhibited apoptotic DNA fragmentation (H2O2treatment for 12 h). (B, C) Overexpression of Nkx2.5 inhibited the caspase-3 activation (B) and release of cytochrome C from the mitochondria (C) (H2O2treatment for 6 h).

2.5 Nkx2.5過表達調(diào)控bcl-2和bax表達

Bcl-2與Bax共存于線粒體，組成離子通道，決定線粒體的通透性和功能穩(wěn)定性。但Bcl-2是重要的抗凋亡蛋白，而Bax是促凋亡蛋白，二者的相對比值對決定細胞是否凋亡起關(guān)鍵作用。為了進一步揭示Nkx2.5過表達抗凋亡的分子機制，提取 RNA進行對bcl-2和bax基因表達進行Real-time PCR檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ad-Nkx2.5感染組與Ad-EGFP感染組比較，bcl-2基因表達水平增加了 1.59倍 (P<0.05)，同時bax基因表達水平則被抑制了44% (P<0.01)。但加入H2O2處理后，Ad-EGFP組bcl-2基因上調(diào) 1.35倍，Ad-Nkx2.5組bcl-2基因上調(diào)1.80倍 (P<0.01)；同時Ad-EGFP組bax基因上調(diào)7.39倍 (P<0.01)，Ad-Nkx2.5組bax基因上調(diào) 1.58倍 (P<0.01)(圖5A和B)。說明Nkx2.5過表達可以顯著抑制Bax基因高表達，從而抑制bcl-2/bax比值顛倒。同時Nkx2.5過表達對bcl-2基因表達具有一個弱的上調(diào)作用。這可能是Nkx2.5過表達保護H9c2細胞抗氧化損傷的分子機制之一。

圖5 Nkx2.5過表達調(diào)控bcl-2和bax表達Fig.5 Overexpression of Nkx2.5 regulates the expression ofbcl-2andbaxgenes. (A and B) Real-time PCR was performed to assess the expression ofbcl-2(A)andbax(B) genes, when H9c2 cells were incubated with 200 μmol/L H2O2for 6 h. Untreated cells infected with Ad-EGFP were used as control group. All data were normalized togapdhmRNA level and showed with relative quantification. Each bar representsx±sfrom three independent experiments. *P<0.05,#P<0.01vsAd-EGFP group (with or without H2O2treatment).

2.6 Nkx2.5核定位不受氧化應激干擾

Nkx2.5是否正確定位與其抗凋亡功能密切相關(guān)，為了解H2O2誘導是否影響Nkx2.5定位，我們構(gòu)建了表達Nkx2.5-EGFP融合蛋白的質(zhì)粒，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染H9c2細胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Nkx2.5-EGFP蛋白定位于細胞核，并在H2O2處理后5 min至24 h內(nèi)仍基本定位于核，未出現(xiàn)明顯的核漿轉(zhuǎn)運。但在已凋亡細胞的固縮核中，Nkx2.5-EGFP蛋白從彌散分布轉(zhuǎn)為聚集散點狀分布 (圖6)。該結(jié)果顯示Nkx2.5蛋白在氧化應激刺激下，核定位穩(wěn)定，可能與其抗凋亡功能相關(guān)。

圖6 H2O2對Nkx2.5核定位的影響Fig.6 The nuclear localization of Nkx2.5 in the absence and presence of H2O2. H9c2 cells stable-transfected with pEGFP-Nkx2.5 were incubated with 200 μmol/L H2O2for 24 h. The subcellular distribution of Nkx2.5-EGFP in H9c2 cells was analysed by fluorescence microscopy (400×). Hoechst staining indicated the morphological changes of cell nucleus during apoptosis.

3 討論

Nkx2.5是重要的心肌分化和功能調(diào)控因子。本實驗成功包裝重組 Nkx2.5腺病毒，可應用于多個研究領域，如干細胞向心肌細胞的誘導分化、先天性心臟病及心律失常發(fā)病機制、抗心肌梗死、Nkx2.5分子功能研究等。

在探索提高體外不同來源的干細胞向心肌誘導分化效率時，證明了 Nkx2.5對于心肌的高效特異誘導。在P19畸胎瘤細胞中發(fā)現(xiàn)，過表達Nkx2.5可以讓細胞擺脫對外源誘導劑 (DMSO)的依賴，細胞只要懸浮培養(yǎng)形成擬胚體即可高效率的分化為跳動的心肌細胞[1]。研究亦表明，Nkx2.5轉(zhuǎn)染的骨髓干細胞能表現(xiàn)出部分心肌表型[6,13]。此外，篩選Nkx2.5表達陽性的心肌前體細胞加以擴增和誘導分化，也是目前研究熱點之一[14-16]。通過nkx2.5轉(zhuǎn)基因誘導干細胞向心肌分化，將為臨床上先天性心臟病、心肌梗死、心功能不全等患者提供新的治療手段，改善心功能。

同時，nkx2.5是第一個被檢測出的法樂氏四聯(lián)癥及房室傳導紊亂的致病相關(guān)基因。在人類的先天性心臟病圖譜內(nèi)，有數(shù)十種與nkx2.5突變相關(guān)的疾病，常見的表現(xiàn)型有房室間隔缺損、室間隔缺損、法樂氏四聯(lián)癥、右心室雙出口，以及三尖瓣畸形導致的Ebstein氏畸形等[2,17-18]。nkx2.5突變還與房室傳導阻滯等先天性畸形有關(guān)：nkx2.5單倍劑量不足使 QRS波時限明顯延長，增強了心律失常易感性；而nkx2.5單等位基因敲除或心室部位特異性nkx2.5基因沉默則會導致由于房室結(jié)或房室束發(fā)育不足引起的房室傳導缺陷[2]。通過nkx2.5轉(zhuǎn)基因可能為部分房室傳導阻滯患者提供基因補償。

此外，nkx2.5轉(zhuǎn)基因治療亦可應用于心肌細胞缺損性疾病的治療。心肌細胞凋亡可見于各種心臟疾病，如缺血性心肌梗死、高糖性心肌重構(gòu)、蒽環(huán)類抗癌劑致心肌毒性。Nkx2.5能夠穩(wěn)定心肌細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)、拮抗過氧化氫、阿霉素誘導的超氧化物損傷和凋亡[4-6]。同時，研究顯示Nkx2.5保持完整的結(jié)構(gòu)對其介導抗凋亡作用是必需的。過表達Nkx2.5刪除C端的突變體，發(fā)現(xiàn)抗凋亡的Bcl-xl蛋白表達下降，促凋亡的CAS蛋白增多，細胞更易受到如 H2O2、毒素或者營養(yǎng)缺乏導致的細胞損傷[5]。

但是 Nkx2.5抗凋亡的具體機制目前仍不是十分清楚。就另一心肌發(fā)育關(guān)鍵基因gata4而言，gata4能夠直接上調(diào)抗凋亡基因bcl-2和bcl-xL表達[19-20]，而nkx2.5抗凋亡的下游靶基因則仍然未知。由于缺血性心肌梗死、高糖性心肌重構(gòu)、蒽環(huán)類抗癌劑致心肌毒性，主要通過介導鈣超載、氧自由基產(chǎn)生，經(jīng)線粒體途徑引發(fā)細胞凋亡。我們探討了 Nkx2.5拮抗線粒體途徑凋亡的分子機制。在本實驗中，通過建立 H2O2誘導的 H9c2心肌細胞系凋亡模型，我們發(fā)現(xiàn) Ad-Nkx2.5感染顯著提高了細胞存活率，抑制了 DNA片段化和caspase-3的酶切活化。在線粒體途徑介導的凋亡中，線粒體膜電位消失、通透性增加、細胞色素C釋放是引發(fā)caspase-3活化的起始因素。我們的研究發(fā)現(xiàn)Nkx2.5過表達抑制了細胞色素C從線粒體的溢出，表明Nkx2.5具有穩(wěn)定線粒體通透性和功能的作用。因此推測 Nkx2.5的下游靶基因可能與線粒體膜電位和通透性維持相關(guān)。

線粒體外膜的通透性主要受Bcl-2蛋白家族調(diào)控[12]。根據(jù)其功能可分為兩大類：介導抗凋亡作用的bcl-2、bcl-xL、bcl-w等基因，及介導凋亡作用的bax、bad、bid、bnip3等基因。細胞接受凋亡信號后，Bax從胞漿轉(zhuǎn)移到線粒體外膜，導致細胞色素C釋放。而Bcl-2通過與Bax結(jié)合成異二聚體，阻止Bax的促凋亡作用。本研究發(fā)現(xiàn)，Nkx2.5能夠上調(diào)bcl-2基因表達，下調(diào)Bax基因表達，特別是能夠抑制氧化刺激引發(fā)的Bax基因超表達。提示bcl-2、bax基因可能是Nkx2.5的下游靶基因。但 Nkx2.5是否直接結(jié)合二者的啟動子發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，其具體結(jié)合位點等問題都有待進一步研究。特別值得指出的是，Nkx2.5通常作為一個轉(zhuǎn)錄激活因子而非抑制因子，其通過何種方式抑制bax基因表達將是一個有趣的問題。

此外，我們觀察到 Nkx2.5的核定位性質(zhì)相當穩(wěn)定，即使細胞遭受H2O2刺激，其核內(nèi)Nkx2.5蛋白仍基本定位于核，并未出現(xiàn)顯著地出核現(xiàn)象。這一性質(zhì)可能與其抗凋亡能力相關(guān)，能保證Nkx2.5蛋白在適量氧化刺激下仍正常執(zhí)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能而不會輕易失活。這也顯示了其作為基因治療候選分子的另一優(yōu)勢。

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Recombinant adenovirus overexpressingnkx2.5protects H9c2 cells against H2O2-induced apoptosis

Tao Li1, Kesheng Jiang1, Qin Ruan2, and Zhiqiang Liu3

1Chemistry and Life Science College,Zhejiang Normal University,Jinhua321004,Zhejiang,China
2Xingzhi College,Zhejiang Normal University,Jinhua321004,Zhejiang,China
3Department of Lymphoma and Myeloma,Division of Cancer Medicine,Center for Cancer Immunology Research,the University of Texas M. D. Anderson Cancer Center,Houston,Texas77030,USA

李濤, 姜科聲, 阮琴, 等. 重組nkx2.5腺病毒抑制過氧化氫誘導的H9c2細胞凋亡. 生物工程學報, 2012, 28(10): 1253?1264.

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Received:April 1, 2012;Accepted:June 8, 2012

Supported by:National Natural Sciences Foundation of China (No. 31101057), Youth Foundation of Zhejiang Normal University (No.KYJ06Y10191).

Corresponding author:Tao Li. Tel/ Fax: +86-579-82282269; E-mail: litao@zjnu.cn

國家自然科學基金 (No. 31101057)，浙江師范大學青年基金 (No. KYJ06Y10191) 資助。