Nisin A前體基因nisA的過量表達對Nisin A產(chǎn)量的影響

樊苗苗，邱一敏，劉晨，冀志霞，馬昕，虞沂，陳守文

1 華中農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)業(yè)微生物學國家重點實驗室，湖北 武漢 430070

2 武漢大學藥學院，湖北 武漢 430071

工業(yè)生物技術(shù)

Nisin A前體基因nisA的過量表達對Nisin A產(chǎn)量的影響

樊苗苗1，邱一敏1，劉晨1，冀志霞1，馬昕1，虞沂2，陳守文1

1 華中農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)業(yè)微生物學國家重點實驗室，湖北 武漢 430070

2 武漢大學藥學院，湖北 武漢 430071

Nisin是一種廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)的抗菌素。通過基因工程手段分別構(gòu)建了Nisin A前體結(jié)構(gòu)基因nisA的穿梭表達載體 pMG36ek-nisA和整合型載體 pDG780-nisA，并轉(zhuǎn)入 Nisin A產(chǎn)生菌乳酸乳球菌Lactococcus lactisATCC 11454中，得到兩株基因工程菌FMM1和FMM2。對比工程菌和原始產(chǎn)生菌的生長狀態(tài)及Nisin A產(chǎn)量，結(jié)果表明FMM1的生長速度、生物量以及發(fā)酵液的酸堿度沒有顯著變化，而Nisin A產(chǎn)量提高了31%；相反，F(xiàn)MM2的生物量較原始菌株顯著降低，但Nisin A產(chǎn)量也有一定程度的提高。通過RT-PCR檢測工程菌與原始產(chǎn)生菌Nisin A生物合成基因簇中11個基因的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示FMM1和FMM2的11個基因的轉(zhuǎn)錄水平均有提高，其中FMM1提高更為顯著。因此推測，nisA是Nisin A高產(chǎn)的關(guān)鍵因素之一，其游離型過量表達能顯著提高Nisin A的產(chǎn)量。該研究為采用基因工程手段提高Nisin A的產(chǎn)量提供了新的思路，并對Nisin A的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)有指導意義，同時，也為其他抗菌肽產(chǎn)生菌的基因工程改造提供了參考。

Nisin A，nisA，乳酸乳球菌ATCC 11454，過量表達

Abstract:Nisin is an antimicrobial peptide widely used in food industry. In this study, Nisin A production inLactococcus lactisATCC 11454 was improved by overexpression of Nisin A structural genenisAthrough introducing a shuttle expression vector pMG36ek-nisAand anintegrated vector pDG780-nisAinto the host strain. The differences of growth profiles and Nisin A production level between the two obtained genetic engineering strains FMM1/FMM2 and the parent strain were investigated. Our results show that while the growth profile (the growth rate, biomass and pH) of FMM1 was similar to the parent strain, its Nisin A production increased 31%. In contrast, the biomass of FMM2 was notably lower than the parent strain, while its yield of Nisin A enhanced slightly. The transcription level of genes involved in Nisin A biosynthesis in both engineering strains was further detected by RT-PCR. We found that all the 11 Nisin A biosynthetic genes in FMM1 and FMM2 had a higher transcription level than those in the parent strain, and these genes exhibited more significant increasing degree of transcription level in FMM1 which hosted the autonomous replicatingnisAgene. These data suggest that expression ofnisAmay act as a rate-limit factor in Nisin A biosynthesis. In conclusion, this work provides a new method to improve Nisin A production by increasing the transcription level ofnisA, paving the way to further large-scale industrial production of Nisin A.

Keywords:Nisin A,nisA,Lactococcus lactisATCC 11454, overexpression

乳鏈菌肽 (Nisin)，亦稱乳酸鏈球菌素或尼生素，是乳酸乳球菌Lactococcus lactis某些亞種在生長過程中所產(chǎn)生的一類屬于羊毛硫抗生素家族的天然活性多肽類細菌素。它對許多革蘭氏陽性菌有強烈的抑制作用。1969年，F(xiàn)AO/WHO食品添加劑聯(lián)合專家委員會批準Nisin作為食品添加劑使用；1988年，食品應(yīng)用工業(yè)中評定Nisin為公認安全的 (GRAS)[1]。迄今為止，Nisin是世界上唯一允許在食品防腐方面使用的抗菌素，已被60多個國家和地區(qū)廣泛用于食品防腐保鮮中，并且在醫(yī)藥和輕工業(yè)等領(lǐng)域也極具廣闊的應(yīng)用前景。

Nisin是一種由34個氨基酸組成的抗菌肽，典型特征是分子結(jié)構(gòu)中含有許多稀有氨基酸，以及稀有氨基酸之間形成的 5個硫醚環(huán)[2-3]，其活性分子常以二聚體或是四聚體的形式存在。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)6種Nisin類型 (A，B，C，D，E，Z)，研究最深入的是Nisin A和Nisin Z[4]。Nisin的生物合成涉及到 11個基因，其中，nisA/Z是編碼Nisin的前體肽結(jié)構(gòu)基因[5]，nisRK是Nisin生物合成的雙組分調(diào)控基因[6]，nisI和nisFEG是Nisin抗性基因和免疫基因[7]，其余基因與Nisin后期加工成熟相關(guān)[8-9]。

近年來，隨著Nisin市場需求的擴大以及分子生物學技術(shù)與理論的成熟，人們逐漸摒棄傳統(tǒng)的菌株改良方法，進而將目光轉(zhuǎn)向運用基因工程手段獲取Nisin高產(chǎn)菌株，并取得一定成效。Kim等[10]將 Nisin生物合成相關(guān)的調(diào)控和免疫基因nisRK、nisFEG構(gòu)建在一個16 kb的載體pND300上，在L.lactisATCC 11454中過量表達后，工程菌生長速度加快，而且Nisin產(chǎn)量也提高了20%左右；Wu等[11]利用Mu轉(zhuǎn)座復合體突變技術(shù)來提高Nisin產(chǎn)量，其中有3個突變體Nisin產(chǎn)量降低，其余的沒有提高；胡紅梅等[12]通過增加Nisin產(chǎn)生菌的免疫基因nisI的拷貝數(shù)使Nisin產(chǎn)量提高32%。Cheigh等[13]嘗試在Nisin產(chǎn)生菌中加強表達nisZ、nisRK、nisFEG，其中nisRK、nisFEG的加強表達菌株的Nisin產(chǎn)量有所提高，但是菌體生長速度卻受到影響，而nisZ的加強表達菌株未構(gòu)建成功。

迄今為止，還沒有關(guān)于通過過量表達nisA來提高Nisin A產(chǎn)量的相關(guān)報道。本研究首次通過構(gòu)建前體肽編碼基因nisA的穿梭表達載體和整合載體來提高L.lactisATCC 11454中Nisin A的產(chǎn)量，并對產(chǎn)量提高的分子機理進行了初步探索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌Escherichia coliDH5α、藤黃微球菌Micrococcus luteus、乳酸乳球菌Lactococcus lactisATCC 11454購自美國菌種保藏中心ATCC；大腸桿菌-乳酸菌穿梭表達載體pMG36ek為本實驗室改造并保存，是在pMG36e的多克隆位點Hind Ⅲ位點插入卡那霉素抗性基因片段；含卡那霉素抗性基因的質(zhì)粒pDG780為本實驗室保存；克隆表達載體pMD19-T購自TaKaRa公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

L.lactis: M17培養(yǎng)基，30 ℃靜置培養(yǎng)[14]；E.coli: LB培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)[15]；M.flavus:同乳鏈菌肽效價測定培養(yǎng)基 BHI medium(Difco)，30 ℃靜置培養(yǎng)。

1.1.3 工具酶和試劑

pfuDNA聚合酶、Ex Taq酶、TaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、T4 DNA聚合酶、Klenow fragment、溶菌酶、dNTPs、DNA分子量標準均購自TaKaRa公司；Nisin A標準品購自Sigma公司；RNA Extraction Kit購自 Omega公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自Fermentas公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；DNA片段快速純化/回收試劑盒購自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；其他試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取

大腸桿菌質(zhì)粒 DNA和乳酸菌基因組 DNA的提取方法參見分子克隆[15]；乳酸乳球菌質(zhì)粒DNA的抽提方法參見文獻[16]。

1.2.2 DNA的酶切、純化、連接和轉(zhuǎn)化

DNA的酶切、純化、連接按TaKaRa公司相應(yīng)試劑說明書進行。

1.2.3 感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化

大腸桿菌的感受態(tài)制備和轉(zhuǎn)化參見分子克隆CaCl2介導轉(zhuǎn)化法；乳酸乳球菌的感受態(tài)制備和電轉(zhuǎn)化根據(jù)文獻[17-18]進行。

1.2.4nisA基因與相關(guān)調(diào)控元件的拼接合成及重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

根據(jù)P32啟動子和nisA序列各設(shè)計一對引物 (表1)。其中粗體部分為酶切位點，下劃線為SOE-PCR重疊引物。

表1 本研究中所用的PCR引物Table 1 Primers used in this study

nisA片段擴增以L.lactisATCC 11454總DNA為模板，nisA-F和nisA-R為引物，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 45 s，42 ℃退火45 s，72 ℃延伸30s，共30個循環(huán)；P32片段擴增以pMG36ek質(zhì)粒為模板，P32-F和P32-R為引物，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，62 ℃退火45 s，72 ℃延伸30s，共30個循環(huán)。以PCR純化產(chǎn)物為模板，P32-F和nisA-R為引物，采用重疊延伸 PCR方法[19]拼接合成目的基因 P32-nisA。擴增產(chǎn)物用 2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并純化回收。PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒pMG36ek經(jīng)EcoRⅠ和ClaⅠ雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài) DH5α。涂布于含卡那霉素抗性的 LB平板，37 ℃培養(yǎng)。次日挑取單菌落增菌，提取質(zhì)粒進行 PCR和雙酶切驗證，并測序確證。構(gòu)建的游離型載體命名為 pMG36ek-nisA；將構(gòu)建好的pMG36ek-nisA質(zhì)粒用KpnⅠ和NsiⅠ酶切，得到Er-P32-nisA片段，連接到pDG780載體上，轉(zhuǎn)化驗證步驟同上，得到整合型載體命名為pDG780-nisA。

1.2.5 重組質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化、篩選及驗證

L.lactisATCC 11454感受態(tài)制備與電轉(zhuǎn)化參考文獻[17-18]，電擊后涂布于含紅霉素的GM17平板上，30 ℃培養(yǎng)48 h。挑取單菌落在含紅霉素的GM17液體培養(yǎng)基中增菌后提取質(zhì)粒，因L.lactisATCC 11454含內(nèi)源質(zhì)粒，且外源質(zhì)粒在該菌中拷貝數(shù)極低，故對外源質(zhì)粒進行以下鑒定：1) 取適量質(zhì)粒為模板，用 P32-F和nisA-R為引物進行PCR驗證。2) 經(jīng)PCR鑒定后的質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化到感受態(tài)DH5α，涂布卡那霉素抗性平板；次日挑取單菌落增菌，提取質(zhì)粒作雙酶切鑒定。得到工程菌并命名為 FMM1和 FMM2，連續(xù)傳代十次穩(wěn)定后，進行后續(xù)試驗。

1.2.6 工程菌與原始菌的生長狀況的測定與比較

對FMM1和FMM2的生長曲線和發(fā)酵液的pH變化進行測定，實驗重復3次。

1.2.7 工程菌與原始菌Nisin A產(chǎn)量的測定與比較

采用瓊脂擴散法，參考文獻[20]并略加改進，測定Nisin A效價。以Nisin A標準品作為對照，測定FMM1和FMM2對指示菌M.flavus的抑菌活性實驗，檢測其抑菌圈直徑，根據(jù)直徑大小作標準曲線，再根據(jù)標準曲線公式計算出待測樣品的效價；以原始產(chǎn)生菌L.lactisATCC 11454為對照，實驗重復3次。

1.2.8 RNA的提取和RT-PCR檢測

乳酸乳球菌RNA的提取以及反轉(zhuǎn)錄參見試劑盒說明書，RT-PCR以cDNA為模板，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃，變性 45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸30s，共30個循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳檢測RT-PCR產(chǎn)物。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR拼接合成目的基因及重組質(zhì)粒的構(gòu)建

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，SOE-PCR產(chǎn)物片段約340 bp，符合預(yù)期片段長度 (圖1)。進一步測序鑒定 (測序圖略)，證實與設(shè)計序列一致。按照“材料與方法”中的重組質(zhì)粒構(gòu)建流程，得到游離型載體 pMG36ek-nisA和整合型載體pDG780-nisA(圖 2)，并驗證正確 (圖略)。

2.2 工程菌的構(gòu)建

將游離型載體pMG36ek-nisA和整合型載體pDG780-nisA分別電轉(zhuǎn)化到L.lactisATCC 11454中，以紅霉素抗性為篩選標記篩選陽性轉(zhuǎn)化子，進行 PCR和酶切鑒定 (圖略)。結(jié)果成功獲得Nisin A前體結(jié)構(gòu)基因nisA的過量表達工程菌株FMM1和FMM2。

2.3 重組菌與原始菌的生長狀況的測定與比較

圖1 P32啟動子、nisA及兩者重疊延伸PCR產(chǎn)物的鑒定Fig.1 PCR analysis of P32 promoter,nisAgene and their SOE product. 1: P32, a strong constitutive promoter; 2, 4, 5: 100 bp DNA ladder marker; 3:PCR product ofnisAgene; 6: SOE-PCR product of P32-nisA.

圖2nisA過量表達載體的圖譜Fig.2 Map of the recombinant plasmid fornisAoverexpression. (A) Shuttle expression vector pMG36ek-nisA. (B)Integrated expression vector pDG780-nisA.

為了解nisA基因的過量表達對宿主菌的生長是否造成影響，將過夜培養(yǎng)的FMM1、FMM2和L.lactisATCC 11454分別以1%的接種量轉(zhuǎn)接至新鮮的GM17培養(yǎng)基中發(fā)酵，每2 h取發(fā)酵液測定OD600和pH (圖3)。結(jié)果表明，在發(fā)酵24 h周期內(nèi)，F(xiàn)MM1和出發(fā)菌株L.lactisATCC 11454的生長速率和生物量相近，表明該工程菌中nisA基因的導入對細菌生長基本沒影響；FMM2的生物量則比二者低 10%左右，推測原因可能是pDG780-nisA質(zhì)粒整合入L.lactisATCC 11454基因組后，整合位點周邊基因的表達發(fā)生變化，進而對細胞生長造成影響，具體機制還待深入研究。對3株菌發(fā)酵液的pH檢測顯示無明顯差別。

圖3 工程菌FMM1、FMM2和野生菌L.lactisATCC 11454發(fā)酵過程中OD600和pH變化曲線Fig.3 Cell density (OD600) and pH value of FMM1,FMM2 andL.lactisATCC 11454 culture over a 24 h time period of fermentation.

2.4 工程菌與原始菌Nisin A產(chǎn)量的比較

為檢測nisA的引入對Nisin A產(chǎn)量的影響，本研究采用瓊脂擴散法分別檢測工程菌FMM1、FMM2和原始菌L.lactisATCC 11454的Nisin A產(chǎn)量。將過夜培養(yǎng)物分別以1%的接種量轉(zhuǎn)接至新鮮的GM17培養(yǎng)基中。發(fā)酵第6 h開始取樣，每2 h取一次。以Nisin A標準品作對照，測定發(fā)酵液的抑菌活性 (圖4和表2)。結(jié)果表明，進入發(fā)酵穩(wěn)定期后，F(xiàn)MM1菌株的Nisin A產(chǎn)量顯著提高31%左右；而FMM2菌株的產(chǎn)量提高則穩(wěn)定在8%左右。這說明nisA的加強表達能夠提高Nisin A的產(chǎn)量，因此預(yù)測，進一步改造nisA游離型表達載體，可大幅提高Nisin A產(chǎn)量，繼而通過對其機制研究和優(yōu)化培養(yǎng)，最終應(yīng)用于Nisin A的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。

2.5 工程菌與原始菌的基因表達水平的比較

為進一步了解過量表達nisA致使Nisin A產(chǎn)量提高的機制，本研究分別提取工程菌和原始菌的總RNA，然后通過RT-PCR檢測工程菌與原始菌Nisin A生物合成基因簇中11個基因的轉(zhuǎn)錄水平 (圖 5)。結(jié)果顯示nisA的過量表達能夠提高Nisin A生物合成基因簇的 11個基因的轉(zhuǎn)錄水平，說明Nisin A前體結(jié)構(gòu)基因nisA過量表達可以促使Nisin A基因簇的高效轉(zhuǎn)錄，從而提高Nisin A前體的產(chǎn)量，為其高產(chǎn)提供了可行性策略。

圖4 FMM1、FMM2和L.lactisATCC 11454的Nisin A產(chǎn)量的比較Fig.4 Comparison of Nisin A production of FMM1,FMM2 andL.lactisATCC 11454.

表2 Nisin A產(chǎn)量的比較Table 2 Comparison of Nisin A production among the three strains in the different time

圖5 FMM1、FMM2和L.lactisATCC 11454的Nisin A基因簇的轉(zhuǎn)錄水平比較Fig.5 Comparison of the transcription of Nisin A biosynthesis genes of FMM1, FMM2 andL.lactisATCC 11454.

3 討論

本研究比較了Nisin A前體編碼基因nisA以游離型和整合型方式過量表達對Nisin A產(chǎn)量的影響，結(jié)果表明nisA的游離型過量表達對Nisin A增產(chǎn)有良好的效果，可能因為提高nisA拷貝數(shù)后能夠供應(yīng)更多的Nisin A前體，從而在一定程度上增加了Nisin A的產(chǎn)量。另外，nisA整合型過量表達菌株的Nisin A產(chǎn)量也有較大提高，但菌株的生物量明顯降低，可能因為外源基因整合入基因組后，整合位點上下游基因的表達受到影響，從而改變了宿主菌生理狀態(tài)所致。為從分子水平上解釋工程菌株Nisin A產(chǎn)量提高機理，本研究對工程菌株進行了RT-PCR實驗，結(jié)果表明，游離型工程菌FMM1中nisA的過量表達可以促使Nisin A基因簇中大部分基因的高效轉(zhuǎn)錄，尤其與前體肽修飾相關(guān)的nisB(脫水酶) 和nisC(環(huán)化酶) 的轉(zhuǎn)錄水平顯著增加，從而使Nisin A合成量提高 31%；另一方面，整合型工程菌FMM2中nisA的加強表達在一定程度上可以提高nisB和nisC的轉(zhuǎn)錄水平，但是相比于FMM1，F(xiàn)MM2中負責前體肽切割的nisP轉(zhuǎn)錄量降低，這可能是導致其成熟的 Nisin A產(chǎn)量較低的原因；同時，可能由于FMM2的單位菌體Nisin A產(chǎn)量增加，其免疫基因nisI的表達量大幅增加以提高菌體的耐受性，但是具體分子機制還有待進一步揭示。此外，實驗結(jié)果也暗示nisA基因?qū)ζ渌鸑isin A生物合成相關(guān)基因的表達具有協(xié)同效應(yīng)，這在Nisin A生物合成研究中也是首次報道。與此同時，本研究也嘗試了通過過量表達nisRK與nisFEG提高Nisin A的產(chǎn)量，結(jié)果也能夠使Nisin A的產(chǎn)量提高 (結(jié)果未顯示)，并且根據(jù)文獻報道[13]，在Nisin Z產(chǎn)生菌L.lactisA164中過量表達nisRK和nisFEG能夠使Nisin Z的產(chǎn)量提高 56%，這與我們的結(jié)果一致。因此推測，在Nisin A的生物合成過程中調(diào)控基因和免疫基因?qū)isin A產(chǎn)量也有影響，其分子機理還有待進一步探討。

綜合以上結(jié)果，本研究一方面通過基因工程手段提高了Nisin A的產(chǎn)量，彌補了傳統(tǒng)工業(yè)生產(chǎn)弊端，為Nisin A規(guī)?；a(chǎn)和后續(xù)研究奠定了一定的基礎(chǔ)；另一方面，相比其他Nisin類型，針對Nisin A高產(chǎn)工程菌株的構(gòu)建，優(yōu)選方案是有效提高其生物合成前體物的供應(yīng)，本研究將進一步改造nisA游離型表達載體，并嘗試利用其他啟動子帶動nisA的高效轉(zhuǎn)錄，更大幅度地提高Nisin A的產(chǎn)量。

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Effect of overexpressing Nisin A structural genenisAon Nisin A production

Miaomiao Fan1, Yimin Qiu1, Chen Liu1, Zhixia Ji1, Xin Ma1, Yi Yu2, and Shouwen Chen1

1State Key Laboratory of Agricultural Microbiology,Huazhong Agricultural University,Wuhan430070,Hubei,China
2School of Pharmaceutical Sciences,Wuhan University,Wuhan430071,Hubei,China

樊苗苗, 邱一敏, 劉晨, 等. Nisin A前體基因nisA的過量表達及其對Nisin A產(chǎn)量的影響. 生物工程學報, 2012, 28(10):1175?1183.

Fan MM, Qiu YM, Liu C, et al. Effect of overexpressing Nisin A structural genenisAon Nisin A production. Chin J Biotech,2012, 28(10): 1175?1183.

Received:March 19, 2012;Accepted:May 19, 2012

Supported by:The "Dawn" Program of Wuhan Science and Technology Bureau for Young Scholars (No. 201050231069).

Corresponding author:Shouwen Chen. Tel: +86-27-87283005-8102; E-mail: chenshouwen@mail.hzau.edu.cn

Yi Yu. Tel: +86-27-68752491; E-mail: yu_yi@whu.edu.cn

武漢市科技局晨光計劃 (No. 201050231069) 資助。