中藥柿霜中糖組分的氣相色譜法分析

王灝然，鐘曉紅，陸 英，張 雙，張 喻，何艷君，周 敏

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128）

柿霜是柿餅生產(chǎn)后期與儲(chǔ)藏過(guò)程中在其表面出現(xiàn)的白色顆粒狀物。據(jù)《隨息居飲食譜》記載：柿霜，乃柿之精華，甘涼清肺，治吐血、咯血、勞嗽、咽喉口舌諸病甚良”?！夺t(yī)學(xué)衷中參西錄》也記載有：“柿霜入肺，而甘涼滑潤(rùn)。其甘也，能益肺氣；其涼也，能清肺熱；其滑也，能利肺痰；其潤(rùn)也，能滋肺燥”。由于柿霜具有較高的保健作用，現(xiàn)今柿霜除了用作中藥外，還開發(fā)有柿霜糖等產(chǎn)品。在大眾越來(lái)越注重養(yǎng)生與健康的今天，對(duì)柿霜的深入研究有著重要的意義。

柿霜是柿餅中可溶性糖隨水滲出果面，待水分蒸發(fā)散失后，凝結(jié)成的白色結(jié)晶固體。柿餅出霜時(shí)分兩個(gè)步驟：（1）柿餅內(nèi)可溶性糖隨水分外滲至表面；（2）表面水分蒸發(fā)散失后，殘留下的糖凝結(jié)成固體。糖類是柿霜中的重要成分之一,因此本文旨在對(duì)柿霜中糖類組分進(jìn)行測(cè)定分析，以期為柿霜的開發(fā)及其綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

中藥柿霜樣品：中藥店采購(gòu)，產(chǎn)地為山東省菏澤市曹州和湖北省黃岡市團(tuán)風(fēng)。氯仿、鹽酸羥胺、吡啶、乙酸酐、三氟乙酸、正丁醇等試劑均為分析純；單糖標(biāo)準(zhǔn)品：葡萄糖（D-Glucose）、核糖（D-Ribose）、阿拉伯糖（L-Arabinose）、半乳糖（D-Galactose）、甘露糖（D-Mannose）、鼠李糖（L-Rhamnose）、巖藻糖（D-Fucose）均為生化試劑，力博生化試劑公司。GC2010氣相色譜儀，日本島津。

1.2 中藥柿霜樣品的前處理

分別稱取曹州樣品和團(tuán)風(fēng)樣品1 g，充分溶解，定容至100 mL。將配好的樣品分別加入25 mL Sevag試劑（氯仿∶正丁醇=4∶1），劇烈振蕩 30 min 后靜置30 min，離心除去沉淀（雜質(zhì)和蛋白）之后，真空干燥，即得曹州柿霜和團(tuán)風(fēng)柿霜的多糖樣品。

1.3 單糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生物的制備

分別準(zhǔn)確稱取7種標(biāo)準(zhǔn)單糖——葡萄糖、核糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖和巖藻糖各10 mg，置于10 mL具塞刻度試管中，加入10 mg鹽酸羥胺，1.0 mL吡啶，于90℃水浴振蕩反應(yīng)15 min，冷卻至室溫。再加入1.0 mL乙酸酐，90℃水浴繼續(xù)反應(yīng)30 min，生成糖腈乙酸酯衍生物。冷卻后，分別加入1 mL氯仿萃取3次，取氯仿層進(jìn)行分析。

1.4 氣相色譜條件

Rtx-1701毛細(xì)管色譜柱，內(nèi)徑0.25 mm，柱長(zhǎng)30 m，液膜厚度0.25 μm。進(jìn)樣口溫度240℃；載氣為高純氮?dú)?，流?0 mL/min；氫氣流速40 mL/min，空氣流速 400 mL/min。進(jìn)樣量 1 μL，分流比為1/20，總流量17.1 mL/min，柱流量0.67 mL/min。氫火焰離子化檢測(cè)器溫度260℃。柱溫采用程序升溫，先升溫至180℃，然后以 2℃/min的速度升至220℃，保持 10 min。

1.5 混合標(biāo)樣的制備

分別從已配置好的7種單糖糖腈乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)品衍生物中取0.3 mL，加入同一支具塞試管中，即可得混合標(biāo)樣，直接進(jìn)行氣相色譜分析。

1.6 樣品的水解和衍生

分別稱取純化后的柿霜多糖曹州樣品和團(tuán)風(fēng)樣品各50 mg于具塞試管中，各加入2 mol/L三氟乙酸4 mL，充氮?dú)夥夤芎笥?20℃水解5 h。取出樣品溶液于65℃水浴中用氮?dú)獯蹈伞Ｖ笤俜謩e加入50 mg鹽酸羥胺和3.0 mL吡啶，在90℃水浴條件下振蕩反應(yīng)15 min，冷卻至室溫后分別加入3.0 mL乙酸酐，90℃水浴繼續(xù)反應(yīng)30 min，反應(yīng)產(chǎn)物冷卻后各加入3 mL氯仿萃取3次，進(jìn)行氣相色譜分析。

1.7 單糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生物的標(biāo)準(zhǔn)曲線

氣相色譜分析標(biāo)準(zhǔn)品單糖糖腈乙酸酯衍生物，進(jìn)樣量為 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μL，與其對(duì)應(yīng)的峰面積作成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 混合標(biāo)樣的氣相色譜分析

由混合標(biāo)準(zhǔn)單糖糖腈乙酸酯衍生物的氣相色譜圖可見(jiàn)（圖1），7種單糖均得以良好分離，分析過(guò)程中均不產(chǎn)生異構(gòu)峰。其中保留時(shí)間分別是：鼠李糖11.786 min、核糖12.455 min、阿拉伯糖13.089 min、巖藻糖 13.453 min、甘露糖 21.128 min、葡萄糖22.514 min、半乳糖 23.631 min。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)單糖糖腈乙酸酯衍生物的氣相色譜圖

2.2 中藥柿霜樣品的氣相色譜分析

2.2.1 曹州樣品的氣相色譜分析 由圖2可知，在與標(biāo)準(zhǔn)品相同的色譜條件下，保留時(shí)間可作為定性分析的依據(jù)，通過(guò)與圖1中標(biāo)準(zhǔn)品單糖糖腈乙酸酯衍生物的保留時(shí)間相比較，即可檢測(cè)到柿霜曹州樣品含有鼠李糖、核糖、阿拉伯糖、葡萄糖這4種單糖（圖2）；未檢測(cè)到巖藻糖、半乳糖及甘露糖。

圖2 曹州樣品糖腈乙酸酯衍生物的氣相色譜圖

2.2.2 團(tuán)風(fēng)樣品的氣相色譜分析 由圖3可知，通過(guò)與圖1中單糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間相比較，檢測(cè)到柿霜團(tuán)風(fēng)樣品含有核糖、巖藻糖、葡萄糖這3種單糖；未檢測(cè)到鼠李糖、半乳糖、甘露糖以及阿拉伯糖。

圖3 團(tuán)風(fēng)樣品糖腈乙酸酯衍生物的氣相色譜圖

其中兩種中藥柿霜樣品均含有葡萄糖和核糖，而未檢測(cè)出甘露糖和半乳糖。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)單糖糖腈乙酸酯衍生物的線性回歸方程

將已檢測(cè)到的中藥柿霜中所含有種類的單糖糖腈乙酸酯衍生后，按1.7的方法處理，根據(jù)不同的進(jìn)樣量即可得知對(duì)應(yīng)的峰面積。由10 mg的單糖標(biāo)準(zhǔn)品，配成了1 mL的待測(cè)品，根據(jù)進(jìn)樣量的不同，可以對(duì)應(yīng)得到該進(jìn)樣量中所含的單糖糖腈乙酸酯衍生物量（單位：mg）。因此，根據(jù)峰面積（y）和所含的單糖標(biāo)準(zhǔn)品量（x）即可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線以及對(duì)應(yīng)的線性回歸方程，線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)如表1所示。

表1 標(biāo)準(zhǔn)單糖含量測(cè)定的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)

2.4 中藥柿霜樣品中糖組分的含量分析

由表1中的線性回歸方程和圖2、3中所示4種單糖糖腈乙酸酯衍生物的峰面積，即可算得曹州和團(tuán)風(fēng)樣品中各單糖組分的含量及其所占比例（表 2）。

表2 曹州樣品和團(tuán)風(fēng)樣品的糖組分分析

2.5 氣相色譜法分析中藥柿霜樣品的精密度

將各相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)品單糖糖腈乙酸酯衍生物取等量（1 μL）在同樣的檢測(cè)條件下，進(jìn)行了5次重復(fù)試驗(yàn)，計(jì)算平行測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。其中葡萄糖、核糖、阿拉伯糖、鼠李糖和巖藻糖的RSD分別為1.27%、1.54%、0.90%、1.38%、1.09%，均小于2.0%，可見(jiàn)該處理和檢測(cè)方法重復(fù)性較好，精密度較高。

3 結(jié)論與討論

3.1 糖腈衍生化方法

糖腈衍生化的方法能較好的實(shí)現(xiàn)中藥柿霜樣品多糖水解產(chǎn)物的衍生。衍生物經(jīng)氯仿萃取后沒(méi)有發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的色譜峰拖尾情況，適合單糖衍生化氣相色譜法分析。柿霜樣品多糖的水解較關(guān)鍵，試驗(yàn)過(guò)程中采用三氟乙酸解決了硫酸水解多糖的炭化問(wèn)題。經(jīng)試驗(yàn)探索，中藥柿霜水解的最佳溫度為120℃，最佳水解時(shí)間是5 h，這樣處理雜質(zhì)峰和異構(gòu)峰較少。在處理單糖標(biāo)準(zhǔn)品水解時(shí)，第一階段水解最佳時(shí)間為15 min，加入乙酸酐后的最佳水解時(shí)間為30 min，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致雜質(zhì)峰和異構(gòu)峰較多，影響檢測(cè)結(jié)果。水浴衍生化應(yīng)在密封條件下進(jìn)行。90℃水浴時(shí)，水蒸氣較多，若不密封，進(jìn)入試管會(huì)使乙酸酐分解成乙酸，使衍生化不完全，導(dǎo)致檢測(cè)時(shí)雜質(zhì)峰較多，結(jié)果不準(zhǔn)確。

3.2 氣相色譜方法

氣相色譜法分析具有高分離效能、高檢測(cè)效能的特點(diǎn)，分析結(jié)果準(zhǔn)確，尤其是對(duì)于含量較低的組分。本試驗(yàn)采用中等極性的Rtx-1701毛細(xì)管色譜柱，在30 min內(nèi)完成了7種單糖的分析，各單糖均能完全分離，分析過(guò)程中不產(chǎn)生異構(gòu)峰，重復(fù)性較好，精密度較高，是一種較為準(zhǔn)確可靠的分析方法。在色譜條件的選擇上，2℃/min的升溫程序既可以將7種單糖完全分離，又避免了升溫過(guò)慢導(dǎo)致的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。進(jìn)樣口選擇240℃最為適合，若溫度過(guò)高會(huì)產(chǎn)生個(gè)別峰重疊的結(jié)果，無(wú)法完全分離。柱溫選擇180℃，若低于180℃，分析周期過(guò)長(zhǎng)；若柱溫過(guò)高也會(huì)產(chǎn)生個(gè)別峰重疊的結(jié)果，影響檢測(cè)。

3.3 糖組分分析

由分析結(jié)果可知，兩種中藥柿霜均含有較多的葡萄糖，但所占比例有一定的差異，曹州樣品和團(tuán)風(fēng)樣品分別含有27.65%和23.67%的葡萄糖。曹州柿霜樣品中還含有核糖、阿拉伯糖和鼠李糖，其中核糖和阿拉伯糖的含量也較多，鼠李糖的含量較少；而團(tuán)風(fēng)樣品中含有核糖和巖藻糖，其中核糖含量較多，巖藻糖含量較少。通過(guò)對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)，兩種樣品中核糖的含量比較接近。兩種中藥柿霜均未檢測(cè)到甘露糖和半乳糖?？梢?jiàn)不同來(lái)源的中藥柿霜在糖的組分上存在著較大的差異。

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