高效液相色譜法檢測水產(chǎn)品中的孔雀石綠

萬譯文 ，洪 波，曾春芳，劉 麗 ，肖 維 ，黃華偉

（1.農(nóng)業(yè)部漁業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（長沙），湖南 長沙 410153；2.湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所，湖南 長沙 410153）

隨著人們對食品安全要求的提高和國際貿(mào)易的發(fā)展，世界各國對食品檢測的項目越來越多，對農(nóng)藥殘留分析技術(shù)的靈敏度、特異性和快速性提出了更苛刻的要求?？兹甘G是一種帶有金屬光澤綠色的結(jié)晶體，化學(xué)名稱為四甲基代二氨基三苯甲烷，分子式（C23H25ClN2），易溶于水、甲醇、乙醇和戊醇，水溶液呈藍綠色。它可用來作殺菌劑、驅(qū)蟲劑，是藥物染料中抗菌效力較強的一類，屬于三苯甲烷類染料[1]。水產(chǎn)品中孔雀石綠的檢測方法主要采用高效液相色譜法[2]及液質(zhì)聯(lián)用法[3-4]。目前國內(nèi)檢測孔雀石綠通常采用液相色譜－紫外檢測器法（柱后衍生法）[5]，執(zhí)行SC/T 3018-2004水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。此方法需要在色譜柱后連接二氧化鉛氧化柱，把無色孔雀石綠轉(zhuǎn)化成有色孔雀石綠，可以同時檢測水產(chǎn)品中有色孔雀石綠和無色孔雀石綠的含量。大部分檢測孔雀石綠采用國標(biāo)GB/T 20361-2006，方法原理是將有色孔雀石綠經(jīng)硼氫化鉀溶液還原為無色孔雀石綠，然后用液相色譜法熒光檢測器檢測，這個方法大大降低了檢測限，可以滿足對歐盟及日本出口的條件。因此，我們在采用國標(biāo)實驗過程中將發(fā)現(xiàn)的問題進行了總結(jié)，并簡化了試驗步驟，節(jié)約了前處理時間，建立了高效液相色譜法檢測水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝物無色孔雀石綠的方法。采用該方法能得到較高的回收率和較低的檢出限，在水產(chǎn)品痕量孔雀石綠的檢測中具有廣泛的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 試劑

孔雀石綠（分析純，含量≥99.5%，上海哈姆科技有限公司公司）；乙腈（色譜純，含量≥99.9%，美國TEDIA公司）；冰醋酸（優(yōu)級純，含量≥99.5%，天津科密歐公司）；乙酸銨（分析純，含量≥98.0%，廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心）；鹽酸羥氨（分析純，含量≥98.5%，湖南匯虹試劑有限公司）；對甲苯磺酸（分析純，含量≥99.0%，湖南匯虹試劑有限公司）；二氯甲烷（分析純，含量≥99.5%，湖南匯虹試劑有限公司）；二甘醇（分析純，99.0%，成都金山化工試劑廠）；酸性氧化鋁（分析純，100～200目，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。提取液：稱取鹽酸羥氨13.40 g，對甲苯磺酸0.84 g，乙酸銨0.48 g，混放入燒杯中用去離子水溶解，轉(zhuǎn)移到500 mL的容量瓶中，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至4.5，定容。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜配RF-0AXL熒光檢測器（日本島津）；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮化儀器廠）；高速冷凍離心機（德國HEMEL公司）；XW-80A微型漩渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）；電子天平（島津國際貿(mào)易公司）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

準(zhǔn)確稱取孔雀石綠0.010 g，用乙腈溶解，定容于100 mL容量瓶中，即得質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液。使用時再用乙腈稀釋成相應(yīng)濃度的溶液。

1.4 液相色譜條件

色譜柱：ODS－C18柱，250 mm×4.6 mm，粒度 5 μm；流動相為 0.1 mol/L（pH 值 4.5）的乙腈：乙酸銨緩沖液（75∶25），流速為 1.0 mL/min；柱溫為 35℃；激發(fā)波長265 nm，發(fā)射波長360 nm；進樣量20 μL。

1.5 方法

1.5.1 提 取 稱取處理好的樣品約5.00 g置于50 mL離心管中，依次加入混合提取溶液20 mL、二甘醇2 mL、酸性氧化鋁5 g，混勻。超聲10 min，5 000 r/min離心10 min，取上清液至150 mL分液漏斗。繼續(xù)向離心管中加入15 mL的乙腈，充分混勻，5 000 r/min離心10 min，取上清液并入150 mL分液漏斗中，重復(fù)一次。

在分液漏斗中加入15 mL的二氯甲烷，具塞，劇烈振搖2 min，靜置分層，將下層溶液轉(zhuǎn)移至100 mL雞心瓶中。在分液漏斗再加入5 mL乙腈，10 mL二氯甲烷，振搖2 min，靜置分層，將下層溶液并入雞心瓶。45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用3 mL乙腈溶解殘渣。

1.5.2 凈 化 將PRS柱子接到固相萃取裝置上，上端接中性氧化鋁柱，先用5 mL的乙腈分兩次活化柱子，轉(zhuǎn)移提取液到柱上，然后用4 mL乙腈分兩次洗滌雞心瓶，每次2 mL，洗液加入0.1 mL硼氫化鉀，輕輕振搖，依次過柱，棄去中性氧化鋁柱，抽PRS柱近干，最后用3 mL洗脫液洗脫，過0.45 μm濾膜，供液相色譜測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)曲線

配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液0.001、0.002、0.010、0.040、0.100、0.200 μg/mL，測定的線性范圍為 0.001～0.2 μg/mL，線性回歸方程 Y=0.164 a+0.051 7，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9，結(jié)果表明孔雀石綠在0.001～0.2 μg/mL范圍內(nèi)具有很好的線性，孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。Kamila等[6]研究認為孔雀石綠和無色孔雀石綠溶液能在光照下降解，光氧化生成脫甲基化合物，而添加抗壞血酸能緩解降解過程。SC/T 3018-2004標(biāo)準(zhǔn)要求樣品在前處理過程中盡量避光進行，也是由于孔雀石綠溶液的光降解特性。

圖1 孔雀石綠校正曲線

2.2 最低檢測限

取樣量不同，方法的檢出限也不同，本試驗采用5 g的取樣量，最后3 mL定容，以3倍噪音信號為最低檢出濃度，求出最低檢出限為0.5 μg/kg，可滿足歐盟對我國水產(chǎn)品中孔雀石綠檢測的要求（2 μg/kg）。

2.3 加標(biāo)回收率的測定

在5 g草魚、鯽魚、鳙魚樣品中分別加入250、500和1 000 μL濃度為100 μg/L的孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液（添加水平分別相當(dāng)于 5、10、20 μg/kg），用玻棒攪勻，靜置30 min，樣品前處理后按方法所述中的色譜條件測定，對每個添加水平作5個平行，再重復(fù)2次，最后計算孔雀石綠的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，以分別考察方法的回收率和精密度。由表1可知，回收率為75.08%～95.13%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.7%～7.1%。該加標(biāo)回收率在70%～120%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15%，符合檢測要求。由圖2可知，往空白樣添加孔雀石綠標(biāo)液5 μg/kg，孔雀石綠目標(biāo)峰在色譜圖中得到較好的分離并且峰形尖銳，回收率良好。

表1 回收率與精密度 （%）

圖2 空白樣品（A）和5 μg/kg加標(biāo)樣品（B）的色譜圖

3 結(jié)論

用乙腈、乙酸銨緩沖溶液提取水產(chǎn)樣品中孔雀石綠后，乙腈再提取，二氯甲烷反萃??；并結(jié)合勻漿、振蕩提取、固相萃取等一系列提取凈化步驟，成功地進行了水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量的檢測。該方法回收率較高，可用于水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留的批量檢測，是水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝物殘留量快速而準(zhǔn)確的檢測方法。

[1]GB/T 19857-2005水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量和測定[S].

[2]孫貝貝，房文紅.高效液相色譜技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（35）：20454-20456，20490.

[3]Peter S,Alder A B.Determination of residues of malachite green in finfish by liquid chromatography tandem mass spectrometry[J].Analytica Chimica Acta,2005，529:173-177.

[4]Luis V,Cecilia D,Andonia L Z,et al.Determination of the sum of malachite green and leucomalachite green in salmon muscle by liquid chromatography atmospheric pressure chemical ionisation mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A,2005,1067（1/2）:101-105.

[5]林 謙，林 煒，葉瑞洪.紫外可見分光光度法測定水產(chǎn)品中孔雀石綠含量[J].福建師范大學(xué)福清分校學(xué)報，2009，（5）：60-64.

[6]Kamilia M,Andrzej P,Jan Z.Determination of malachite green and leucomalachite green in carp muscle by liquid chromatography with visible and fluorescence detection[J].Journal of Chromatography A,2005，1089:187-192.