小麥葉片色素的分離與理化性質(zhì)研究

王 超，王文秀,2，張兵濤,3

（1.濟寧學(xué)院生命科學(xué)與工程系，山東 曲阜 273155；2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266001；3.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800）

色素分為天然色素（Natural Pigments）和合成色素，前者是指直接從生物中提取出來的色素，后者是指人工合成的色素[1]。目前研究較多的天然色素主要是葉綠素和類胡蘿卜素。葉綠素包括葉綠素a，葉綠素b；類胡蘿卜素分胡蘿卜素（Carotenes）和葉黃素類（Xanthophylls），前者是不含氧的類胡蘿卜素的總稱，后者是含氧類胡蘿卜素的總稱，它又包括葉黃素（1utein）、玉米黃質(zhì)、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、隱黃質(zhì)、紫黃質(zhì)、新黃質(zhì)、花藥黃質(zhì)、正未黃素、番茄紅素、辣椒紅素等。

類胡蘿卜素按其化學(xué)結(jié)構(gòu)和溶解性又可分為胡蘿卜素和葉黃素兩類。類胡蘿卜素系共軛烯烴，能有效防止自由基對脂質(zhì)內(nèi)側(cè)生物膜的損害。在植物中類胡蘿卜素擔(dān)當(dāng)葉綠體光合作用的輔助色素并保護葉綠素免受強光破壞，同時也是合成植物激素ABA的前體。葉黃素類系共軛多烯烴的含氧衍生物，是有效的氧自由基捕獲劑[2]。其中玉米黃色素存在于很多植物中，作為單線態(tài)氧及自由基的清除劑，與氧以及由亞油酸氧化而產(chǎn)生的自由基快速反應(yīng)，阻止脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的鏈式傳遞，其抗氧化效果與二丁基羥基甲苯（BHT）相當(dāng)，將成為新一代營養(yǎng)抗氧化劑。紫黃質(zhì)（violaxanthin，V）、花藥黃質(zhì)（antheraxanthin，A）和玉米黃質(zhì)（zeaxanthin，Z）參與葉黃素循環(huán)[3]，其中A和Z在光破壞防御過程中起重要作用[4－5]。

天然色素的開發(fā)與應(yīng)用已成為研究的熱點[6]，許多天然色素在植物體中是穩(wěn)定的，但被分離后容易受各種因素（如光照、溫度、氧化、pH值、介質(zhì)極性、金屬離子、添加劑等）的影響而發(fā)生褪色、變色等變化而影響其著色效果，嚴重制約了天然色素代替人工合成色素的進程[7－8]。在食品工業(yè)生產(chǎn)實踐中，Vc和山梨酸鉀是常用的食品添加劑，這些物質(zhì)對于葉綠體中色素結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響還未見報道。以小麥葉片作為試驗材料，分離葉綠體中常見的8種色素并研究其理化性質(zhì)，其中重點研究了葉綠體色素分離后，不同濃度的Vc和山梨酸鉀處理對于其穩(wěn)定性的影響，旨在為天然色素的研究和其在食品生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗所用小麥品種為濟麥22。小麥種子浸泡過夜，轉(zhuǎn)入鋪有4層紗布的培養(yǎng)皿中。在室溫下培養(yǎng)至2葉一心期，選擇旗葉為供試材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 葉綠體中色素的提取 稱取小麥葉片0.5 g，剪碎，加少許石英砂和碳酸鈣粉，先加少量100%丙酮，把材料研磨成勻漿，再加入丙酮提取色素，最終定容至5 mL，然后于3 500 g離心5 min，上清液即為葉綠體色素的提取液。

1.2.2 葉綠體色素的分離 采用硅膠板薄層層析法（TLC）。硅膠板（規(guī)格：100 mm×200 mm，厚度：0.20～0.25 mm，青島海洋化工廠分廠）使用前在106℃烘干1 h。展層劑為石油醚（沸程 60～90℃）∶異丙醇∶水=100∶12∶0.25（V∶V），總體積為 100 mL。用微量進樣器抽取色素提取液，在距離底邊2 cm將樣品點成一條直線，用冷風(fēng)吹干后重復(fù)點樣，點樣控制在80～100 μL之間。點樣后將硅膠板放入層析缸中于暗處展層，當(dāng)展層劑到達頂部時取出硅膠板，記錄各色素位置并依次將其刮下用乙醇溶解，提取液于3 500 g離心5 min，取上清液備用。

1.2.3 小麥葉片色素最大吸收波長的測定 將分離得到的8種色素溶液分別置于723PC分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）中進行波長掃描（400～800 nm），記錄各色素的最大吸收波長。

1.2.4 光照對小麥葉片類胡蘿卜素含量的影響

稱取小麥葉片0.2 g，加95%的乙醇定容至50 mL，放于BIC-250人工氣候箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）中，25℃黑暗浸提24 h。然后用紗布過濾，除去葉片，置于15 000 lx光強下照射，在10 h內(nèi)每隔1 h測定色素提取液的吸光度值，根據(jù)公式：Cc=（1 000 A470-2.05 Ca-114.8 Cb）/245 計算類胡蘿卜素含量。

1.2.5 不同光照時間對小麥葉片各色素吸光度值的影響 取8種色素提取液分別放置于8個比色皿中，并在其最大吸收峰下測定其吸光度值，然后將比色皿依次放進BIC-250人工氣候箱中（溫度為25℃，濕度為43%，光照為15 000 lx），在7.5 h內(nèi)每隔0.5 h測量其在最大吸收波長下的吸光度值。

1.2.6 不同溫度對小麥葉片各色素吸光度值的影響 取8種色素溶液，置于離心管中各3 mL（離心管提前用黑色不透光的塑料膜包好，以避免光照對色素穩(wěn)定性造成的影響），將色素溶液分別放于4℃、15℃、30℃、45℃、60℃的 DC-2006低溫恒溫槽中30 min，然后用723PC可見分光光度計分別測量其吸光度值。

1.2.7 抗壞血酸（Vc）和山梨酸鉀對小麥葉片類胡蘿卜素含量的影響 稱取小麥葉片0.2 g，加95%的乙醇定容至50 mL，置于BIC-250人工氣候箱中，25℃黑暗處浸提24 h，用紗布過濾。在浸提液中分別加入 0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 g Vc 和山梨酸鉀，然后依次放在15 000 lx光強下照射，每隔1 h測量吸光度值。

以上試驗各重復(fù)3次，所得數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2003進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥葉片葉綠體色素的分離

圖1所示，硅膠板薄層層析系統(tǒng)可將小麥葉片葉綠體色素分離出8個條帶：從下至上依次為：1-新黃質(zhì)（淺黃色）、2-花藥黃質(zhì)（淺黃色）、3-紫黃質(zhì)（淺黃色）、4-玉米黃質(zhì)（淺黃色）、5-葉黃質(zhì)（黃色）、6-葉綠素 b（綠色）、7-葉綠素 a（黃綠色）、8-β-胡蘿卜素（橙黃色），分離效果較好。

2.2 小麥葉片各色素最大吸收波長的測定

對以上8種色素在400～800 nm波長下進行掃描，結(jié)果如表1所示。新黃質(zhì)，花藥黃質(zhì)，紫黃質(zhì)各有3個最大吸收波長，其中新黃質(zhì)在438 nm，花藥黃質(zhì)在447 nm，紫黃質(zhì)在441 nm的最大吸收波長對應(yīng)的吸光度值最大，而玉米黃質(zhì)、葉黃質(zhì)、葉綠素a、葉綠素b、β-胡蘿卜素的最大吸收波長只有一個，分別為 451、446.5、649、665、451 nm 作為其各自的吸收峰值。

表1 小麥葉片8種色素在400～800 nm波長下的最大吸收波長

2.3 不同光照時間對小麥葉片各色素吸光度值的影響

2.3.1 不同光照時間對類胡蘿卜素含量的影響圖2所示，在25℃和15 000 lx光照強度下，小麥葉片葉綠體中類胡蘿卜素的含量隨光照時間的延長而降低，光照3.5 h前下降速率更大。這一結(jié)果說明，光照對小麥葉片葉綠體中類胡蘿卜素穩(wěn)定性的影響明顯。

2.3.2 不同光照時間對各色素吸光度值的影響在15 000 lx光照強度下，每隔0.5 h測定光照對小麥葉片葉綠體中各色素的吸光度值的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)吸光度值隨時間延長普遍下降（圖3），說明這8種色素的穩(wěn)定性都受到光照的影響。其中下降速率最大是葉綠素a和β-胡蘿卜素，說明這兩種色素對于光照更加敏感。葉黃質(zhì)、新黃質(zhì)、花藥黃質(zhì)、玉米黃質(zhì)、紫黃質(zhì)的吸光度值下降速率較慢，可能與這些色素的濃度有關(guān)系。這8種色素在前2 h的吸光度值下降速率最快，說明小麥葉片葉綠體中各色素在光照條件下，前2 h的性質(zhì)最活潑，因此在實際生產(chǎn)中要加強前2 h的避光處理。

2.4 不同溫度對小麥葉片各色素吸光度值的影響

在0～60℃處理下，各色素吸光度值的變化結(jié)果（圖4）表明，不同溫度對于各色素的吸光度值影響較小，其中花藥黃質(zhì)與葉黃質(zhì)的吸光度值變化曲線最小，玉米黃質(zhì)，紫黃質(zhì)和β-胡蘿卜素的吸光度值在30℃附近有最大值?；ㄋ廃S質(zhì)的吸光度值變化趨勢相對穩(wěn)定。

2.5 不同濃度Vc對小麥葉片中類胡蘿卜素含量的影響

在光照條件下在色素提取液中加入Vc，類胡蘿卜素的含量在不同濃度Vc處理下隨光照時間延長呈下降趨勢（圖5），其中加入0.02%Vc時的類胡蘿卜素含量一直比對照要高。結(jié)果說明，在光照條件下，添加0.02%Vc能夠維持較高的類胡蘿卜素含量，其他濃度的Vc維持效果不顯著。

2.6 不同濃度的山梨酸鉀對小麥葉片中類胡蘿卜素含量的影響

圖6所示，小麥葉片中類胡蘿卜素含量在不同濃度山梨酸鉀處理下的變化趨勢與圖5相似。與對照相比，在光照條件下各個濃度的山梨酸鉀對于類胡蘿卜素含量維持效果不顯著。

3 討 論

3.1 薄層層析法分離小麥葉片中的色素

采用硅膠板的薄層層析方法分離小麥葉片色素，得到8個條帶（圖1），這與費美娟等[9]采用硅膠板分離提取菠菜中色素的結(jié)果是一致的。前人的研究確定最大上樣量約300 μL，試驗中發(fā)現(xiàn)最大上樣量需要根據(jù)硅膠板的厚度和含水量來確定。利用試驗中的層析系統(tǒng)分離胡蘿卜和紫薯中的色素時，未出現(xiàn)明顯的條帶。同質(zhì)量的胡蘿卜或紫薯，與小麥葉片相比含水量大很多，因此可能會影響到展層劑對色素的推動作用。

3.2 不同光照時間和溫度對小麥葉片色素吸光度值的影響

光照對小麥葉片葉綠體中的類胡蘿卜素穩(wěn)定性影響較為明顯，并且影響強度隨時間的延長逐漸減小，3.5 h以前下降速率更快（圖2）。類胡蘿卜素是反式的多烯結(jié)構(gòu)，在光照條件下可能會發(fā)生順反式的對調(diào)而成為順式結(jié)構(gòu)。構(gòu)成類胡蘿卜的色素種類很多，在光照條件下哪一種色素對光敏感還未見報道。該試驗進一步研究了光照對于以上8種色素的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葉綠素a和β-胡蘿卜素對光照最敏感，新黃質(zhì)、紫黃質(zhì)、花藥黃質(zhì)次之，玉米黃質(zhì)不敏感（圖3）。相對于光照，4～60℃處理對各色素吸光度值影響不大（圖4），這與李平等[10]對玉米黃色素的溫度影響結(jié)論是一致的。

3.3 不同食品添加劑對小麥葉片色素吸光度值的影響

在食品工業(yè)中，Vc和山梨酸鉀是常用食品添加劑，它們在光照條件下是否對天然色素有所影響，少有報道[11]。該研究發(fā)現(xiàn)，在光照條件下0.02%Vc可以維持較高的類胡蘿卜素含量，其他濃度的Vc和全部濃度的山梨酸鉀效果不顯著。Vc作為還原性物質(zhì)在低濃度下可以緩解天然色素的光解，其機理還需要進一步研究。

綜上所述，光照對于小麥葉片葉綠體中8種色素穩(wěn)定性影響較大，而溫度的影響較小，添加0.02%Vc可以維持較高的類胡蘿卜素含量。這些結(jié)果為天然色素的研究，特別是天然色素食品的生產(chǎn)提供了參考。

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