快速靈敏檢測HCV核心抗原的免疫新方法及其性能分析

毛燕群

（重慶市涪陵監(jiān)獄衛(wèi)生所 408000）

丙型病毒性肝炎是由丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染引起的傳染病，中國HCV感染率約為3.2%，其中40%～60%的感染者可發(fā)展為慢性丙型肝炎，部分發(fā)展為肝硬化，嚴(yán)重威脅人們的健康［1－2］。HCV感染的早期診斷是預(yù)防和治療丙型肝炎的有效途徑。目前HCV檢測技術(shù)主要為抗－HCV抗體檢測和HCV RNA檢測，但二者均存在一定的局限性。外周血中HCV核心抗原（HCV core antigen，HCcAg）是HCV顆粒的結(jié)構(gòu)蛋白，在各亞型HCV中高度保守，是理想的HCV感染標(biāo)志物［3］，其檢測對 HCV感染的診斷和治療具有重要意義。本文針對現(xiàn)存HCcAg檢測方法耗時(shí)、操作繁瑣等不足，建立一種快速靈敏檢測HCcAg含量的電化學(xué)免疫傳感器方法，并對其檢測性能進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與設(shè)備 主要試劑：HCcAg和HCV核心抗體（HCV core antibody，HCcAb）購于美國Thermo公司；多壁碳納米管（multi－wall carbon nanotubes，MWCNTs），純度大于95%，購于成都有機(jī)化學(xué)研究所；牛血清清蛋白（bovine serum albumin，BSA）、殼聚糖（chitosan，CS）及氯金酸購自美國Sigma公司。實(shí)驗(yàn)所 用 緩 沖液 均 為 含 5mmol／L ［Fe（CN）6］3－／4－和0.1mol／L KCl的 0.1mol／L 磷 酸 鹽 緩 沖 溶 液 （phosphate buffered solution，PBS）（pH 7.0），實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸水。主要設(shè)備：CHI 660D電化學(xué)工作站、玻碳電極（工作電極）、鉑絲（對電極）、Ag／AgCl電極（參比電極）、LIBROR AEL－200電子天平（日本島津公司），BRANSON B3200S－T恒溫超聲儀（上海必能信超聲公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 膠體金的制備 采用檸檬酸鈉還原法制備金溶膠［4］，所得金溶膠為酒紅色，用透射電子顯微鏡表征，平均直徑約為16nm。

1.2.2 MWCNTs－CS（1.0g／L）的制備 方法參照文獻(xiàn)［5］，并在此基礎(chǔ)上做了一些改變。配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的醋酸溶液，用NaOH調(diào)節(jié)pH到5.0。取50mg殼聚糖置于10mL上述醋酸溶液中，在室溫下攪拌一段時(shí)間制得5g／L的殼聚糖溶液。將5mg MWCNTs加入5mL 5g／L殼聚糖溶液中超聲溶解。

1.2.3 HCcAg免疫傳感器制作 玻碳電極經(jīng)0.30、0.05μm鋁粉拋光至鏡面后，用水沖洗干凈，分別于雙蒸水、乙醇、雙蒸水中超聲清洗5min，晾干待用。將5μL的MWCNTs－CS滴涂于預(yù)處理的玻碳電極表面，室溫晾干。在膠體金溶液中浸泡4h，取出后水洗，晾干，置于HCcAb溶液中于4℃過夜。最后在室溫下將電極浸入2.5g／L的BSA溶液中1h，以封閉電極上的非特異性吸附位點(diǎn)制成HCcAg電化學(xué)免疫傳感器，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 檢測方法 將HCcAg標(biāo)準(zhǔn)品用雙蒸水進(jìn)行倍比稀釋，配置成200.00、100.00、50.00、25.00、12.50、6.25ng／mL 6個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。在三電極體系下，將制備好的免疫傳感器插入含5mmol／L［Fe（CN）6］3－／4－和0.1mol／L KCl的0.1mol／L PBS溶液（pH 7.0）中，記錄免疫電極在穩(wěn)態(tài)時(shí)的空白電流值I0。然后與不同濃度的HCcAg標(biāo)準(zhǔn)溶液于35℃反應(yīng)20min后，再在工作溶液中進(jìn)行變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）測試，記錄穩(wěn)定后的電流值I1。根據(jù)不同濃度的HCcAg所對應(yīng)的電流差值（ΔI）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中ΔI＝I0－I1。

1.4 性能評價(jià)采用回收試驗(yàn)和干擾試驗(yàn)對該免疫傳感器檢測的準(zhǔn)確性和選擇性進(jìn)行分析，通過批內(nèi)、批間試驗(yàn)評價(jià)傳感器的精密度。（1）回收試驗(yàn)：用標(biāo)準(zhǔn)HCcAg溶液配置出濃度為100.00、50.00、20.00、10.00、5.00ng／mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，將制備好的HCcAg免疫傳感器分別于5個(gè)不同濃度的溶液中孵育20min，根據(jù)測得的實(shí)際濃度與標(biāo)準(zhǔn)濃度的百分比計(jì)算回收率。（2）干擾試驗(yàn)：往濃度為50.00ng／mL的 HCcAg標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別加入2倍濃度的干擾物質(zhì)乙型肝炎病毒表面抗原（hepatitis B virus surface antigen，HBsAg）、乙型肝炎病毒e抗原（hepatitis B virus e antigen，HBeAg）、乙型肝炎病毒核心抗體 （hepatitis B virus core antigen，HBcAg），使 其 濃 度 為100.00ng／mL，加入干擾物前、后的電流值分別為Ia和Ib，按照公式計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），RSD＝（Ib－Ia）／Ia×100%。（3）批內(nèi)試驗(yàn)與批間試驗(yàn)：將制備好的免疫傳感器浸于100.00ng／mL HCcAg標(biāo)準(zhǔn)溶液孵育20min，相同條件下重復(fù)測定5次，計(jì)算批內(nèi)試驗(yàn)CV值；一次制備5支HCcAg免疫傳感器，分別于100.00ng／mL HCcAg標(biāo)準(zhǔn)溶液孵育20min，計(jì)算批間試驗(yàn)CV值。

2 結(jié) 果

HCcAg標(biāo)準(zhǔn)品用雙蒸水進(jìn)行倍比稀釋后，分別采用免疫傳感器對6個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測試，記錄電流變化值ΔI，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。結(jié)果表明，HCcAg濃度在2.50～300.00ng／ml范圍內(nèi)與ΔI成良好的線性關(guān)系，線性方程為：Y＝0.159＋0.128 X，線性相關(guān)系數(shù)R＝0.997。將傳感器在空白溶液中連續(xù)掃描10次，根據(jù)3倍空白標(biāo)準(zhǔn)差與斜率的比值得出其檢出限為1.20ng／mL?；厥赵囼?yàn)結(jié)果見表1；干擾試驗(yàn)結(jié)果見表2；精密度檢測提示批內(nèi)試驗(yàn)CV值為4.5%，批間試驗(yàn)CV值為5.2%。

表1 回收試驗(yàn)

圖1 HCcAg濃度與峰電流變化的線性關(guān)系

表2 干擾試驗(yàn)

3 討 論

HCV為嗜肝性慢性病毒，HCV感染后，患者的起病和臨床癥狀極不典型，以亞臨床感染為多見，容易造成漏診。HCV感染的慢性化發(fā)生率明顯高于乙型肝炎病毒感染。與乙型肝炎比較，丙型肝炎更早出現(xiàn)肝硬化、肝癌，病死率也較高。因此HCV的檢測對HCV感染的早期診斷和指導(dǎo)臨床治療有重要意義。目前用于HCV感染診斷的兩項(xiàng)主要指標(biāo)為抗－HCV和HCV RNA，但存在“窗口期”漏檢的問題。作為抗－HCV檢驗(yàn)的補(bǔ)充試驗(yàn)，HCcAg的檢測對處于HCV感染“窗口期”的個(gè)體檢測有很大價(jià)值。

目前，用于HCcAg檢測的方法主要有熒光酶免疫分析法［6］和酶聯(lián)免疫吸附法［7］，這些檢測方法雖然比較靈敏，但操作繁瑣、費(fèi)時(shí)。電化學(xué)免疫傳感器是基于抗原抗體反應(yīng)可進(jìn)行特異性定量或半定量分析的集成器件，抗原（或抗體）是分子識別元件，且與電化學(xué)傳感元件直接接觸，通過傳感元件把某種或者某類化學(xué)物質(zhì)濃度信號轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的電信號［8］。由于結(jié)合了免疫反應(yīng)的特異性和電化學(xué)傳感技術(shù)的高靈敏度，電化學(xué)免疫傳感器具有選擇性高、成本低和操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于疾病標(biāo)志物的檢測［9］。

本實(shí)驗(yàn)采用 MWCNTs－CS分散液修飾電極，一方面MWCNTs可以極大地促進(jìn)電子傳遞，從而提高電流響應(yīng)，增加檢測靈敏度；另一方面，殼聚糖成膜性好，含有大量氨基，在為HCV核心抗體提供良好的生物相容性環(huán)境的同時(shí)，通過氨基吸附大量的金納米粒子，增加抗體的負(fù)載量，從而也提高檢測的靈敏度。由圖1可知，該電化學(xué)免疫傳感器對HCcAg的響應(yīng)很好，表現(xiàn)出較寬的檢測范圍，HCcAg濃度在2.50～300.00ng／mL范圍內(nèi)與ΔI呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.997。而且檢出限較低，可以檢測到1.20ng／mL的抗原濃度，說明該免疫傳感器的靈敏度較高，可以用來檢測HCcAg含量較低的溶液。

本實(shí)驗(yàn)對制備的HCcAg電化學(xué)免疫傳感器的性能進(jìn)行了評價(jià)。表1為回收試驗(yàn)結(jié)果，通過回收試驗(yàn)反映該方法檢測的準(zhǔn)確性。HCcAg免疫傳感器分別在5個(gè)不同濃度的HCcAg標(biāo)準(zhǔn)溶液中孵育20min，根據(jù)測得的實(shí)際濃度與標(biāo)準(zhǔn)濃度的百分比計(jì)算出回收率，本研究的回收率為96.60%～105.75%，說明該免疫傳感器檢測的準(zhǔn)確性較好。表2為干擾試驗(yàn)結(jié)果，可以用來說明該免疫傳感器檢測的選擇性，將HBsAg、HBeAg、HBcAg作為干擾物質(zhì)，分別加入到50.00ng／mL的HCcAg標(biāo)準(zhǔn)溶液中，使其濃度為100.00ng／mL，比較在有、無干擾物兩種情況下，傳感器的電流變化。由表2可知，加入2倍濃度的干擾物后，RSD為－3.0%～5.7%，表明該免疫傳感器具有良好的選擇性，可較特異地檢測出HCcAg。

此外，作者還分析了該方法的精密度。將免疫傳感器浸到100.00ng／mL HCcAg標(biāo)準(zhǔn)溶液中孵育后，在相同條件下重復(fù)測定5次，RSD為4.5%；將同批次制備的5支免疫傳感器在相同條件下測定，RSD為5.2%，說明該傳感器有良好的重現(xiàn)性。

綜上所述，該電化學(xué)免疫傳感器在檢測HCcAg方面表現(xiàn)出較寬的線性范圍和較低的檢出限，而且具有良好的檢測性能。該方法的建立可以為HCcAg的檢測提供一種新的思路，有助于實(shí)現(xiàn)HCcAg的快速、靈敏檢測，對丙型肝炎的早期檢測具有一定的意義。

［1］ 朱豐村，奚經(jīng)巧.HCV檢測技術(shù)的研究進(jìn)展［J］.實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2008，26（2）：162－165.

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