注射用鹿茸多肽生物活性測(cè)定方法研究

李麗靜，劉少麗，徐 博，劉 佳，王楚盈，吳世佳，張 松

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117)

生物活性檢定是檢定藥品質(zhì)量的重要檢驗(yàn)方法之一，中藥是天然環(huán)境條件中產(chǎn)生的生物制品，具有成分復(fù)雜、可變因素多、活性成分多、作用靶點(diǎn)多、藥效成分和毒性成分不清晰等特點(diǎn)。因此，中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅用理化方法測(cè)定指標(biāo)成分有一定的局限性，而通過(guò)生物活性檢定方法可測(cè)定與臨床相關(guān)的生物學(xué)活性，正適用于中藥這樣具有多種相似生物活性成分的藥品。注射用鹿茸多肽為新鮮或冷凍的鹿茸中提取的骨肽溶液制成的無(wú)菌凍干品，輔料為甘露醇，性狀為白色或類白色塊狀物。藥理學(xué)表明，注射用鹿茸多肽有明顯的促進(jìn)骨生長(zhǎng)作用［1-3］。為更好地控制其生物活性以便指導(dǎo)臨床用藥，本課題嘗試體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞，采用新生大鼠頭蓋骨成骨細(xì)胞和成骨樣細(xì)胞株-人骨肉瘤細(xì)胞MG-63進(jìn)行該藥生物學(xué)活性檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的研究，結(jié)果如下。

1 材料

1.1 動(dòng)物

新生24h內(nèi)健康SD大鼠，吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào)為SCXK－(吉)2007-0003)。

1.2 細(xì)胞株

成骨樣細(xì)胞株-人骨肉瘤細(xì)胞MG-63購(gòu)于中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心，生長(zhǎng)于含10%胎牛血清的含必需氨基酸的DMEM中，常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.3 藥品

注射用鹿茸多肽樣品(批號(hào)110608，25mg)由本課題組自制。

1.4 試劑

Ⅰ型膠原酶(協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心);必須氨基酸(協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心);胰蛋白酶(Sigma公司)青霉素和鏈霉素(Hyclone);L-谷氨酰胺(Sigma);二甲基亞砜(DMSO，Sigma);胎牛血清(Hyclone公司產(chǎn)品)噻唑藍(lán)(MTT，Sigma);DMEM固體培養(yǎng)基(GIBCO公司產(chǎn)品);胰蛋白酶消化液-EDTA(協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心);其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.5 儀器

離心機(jī)(LD4-2A，上海安亭)，酶標(biāo)儀(Model-680，美國(guó)伯樂(lè)公司)，倒置顯微鏡(CKX41，日本奧林巴斯)，二氧化碳培養(yǎng)箱(MCO-175，日本三洋);分析天平(AL-204，Metter-Thermo Group)，生物安全柜(305040195，F(xiàn)rance Thermo)，超純水機(jī)(Human up 900，韓國(guó) Human)。

2 方法

2.1 試劑與藥液的配制

2.1.1 MTT溶液的配制 稱取250mgMTT放入小燒杯中，加50mL PBS(0.01mol/L，pH7.2)在電磁力攪拌機(jī)上攪拌30min，用0.22μm的微孔過(guò)濾器除菌分裝，4℃保存。

2.1.2 藥液的配制 注射用鹿茸多肽臨用前用高糖 DMEM培養(yǎng)基配制，0.22μ微孔濾膜除菌后，給藥時(shí)用高糖DMEM培養(yǎng)基稀釋至所需濃度，作為供試品使用。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)方法

2.2.1 人成骨樣細(xì)胞株MG-63的培養(yǎng)與傳代人成骨樣細(xì)胞株MG-63生長(zhǎng)于含10%胎牛血清維生素 C(50mg/L)，L-谷氨酸(300mg/L)的DMEM培養(yǎng)液中，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化傳代，在37℃ 5%CO2條件下常規(guī)方法培養(yǎng)。

2.2.2 大鼠乳鼠成骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與傳代采用Ⅰ型膠原酶梯度培養(yǎng)法進(jìn)行新生大鼠頭蓋骨成骨細(xì)胞的培養(yǎng)［4、5］，將 24h 內(nèi)出生的 Wistar乳鼠10只直接浸泡于75%酒精中消毒15min，取出放入平皿中。無(wú)菌條件下操作取其頭蓋骨，放入裝有4℃預(yù)冷的PBS液(含100U/mL的青霉素和100μg/mL的鏈霉素)的培養(yǎng)皿中，剔除頭蓋骨骨膜及周圍軟組織，用PBS液清洗后，剪碎至1mm×1mm小片，再用 PBS液沖洗2次。將洗凈的骨組織移入0.25%胰蛋白酶中37℃下消化20min，以消化清除纖維組織，棄掉上清液再將骨片移入0.1%Ⅰ型膠原酶中，37℃下消化60min，用含血清的培養(yǎng)液終止消化，同樣操作重復(fù)2次，合并2次的Ⅰ型膠原酶消化液，離心棄掉上清液，加入細(xì)胞培養(yǎng)液清洗后吹打均勻成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并以終濃度1×106個(gè)/mL接種于25mL培養(yǎng)瓶中(預(yù)置消毒玻片，以便于鑒定細(xì)胞)。在37℃ 5%CO2、飽和濕度恒定條件下培養(yǎng)，隔日觀察、換液。細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層鋪滿培養(yǎng)瓶底，即可進(jìn)行傳代。用0.25%胰蛋白酶消化使貼壁細(xì)胞松解，輕搖培養(yǎng)瓶細(xì)胞即可從培養(yǎng)瓶底部脫落下來(lái)，以終濃度1×104個(gè)/mL接種于新培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以此法培養(yǎng)至第3代細(xì)胞可用于進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

細(xì)胞接種于25mL培養(yǎng)瓶中，每日于倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)中的細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況。細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察貼壁前形態(tài)完整，呈均勻一致的球型，4h內(nèi)細(xì)胞貼壁，細(xì)胞形態(tài)主要有長(zhǎng)梭形、三角型、多角形，形態(tài)相似的細(xì)胞成堆出現(xiàn)，可呈簇生長(zhǎng)。

圖1顯示，MG-63細(xì)胞比較大而豐滿，更大更寬厚一些，生長(zhǎng)速度比較快，一般3d即能長(zhǎng)滿單層;大鼠原代培養(yǎng)的頭蓋骨成骨細(xì)胞較小且狹長(zhǎng)，鏡下顏色比較淺，第1代生長(zhǎng)比較緩慢，大概7d～10d長(zhǎng)成單層，傳代后生長(zhǎng)速度比加快而且比較穩(wěn)定。但總體形態(tài)相似，從形態(tài)上保留了成骨細(xì)胞的特征。

圖1 倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)(×10)

2.4 注射用鹿茸多肽促成骨細(xì)胞增殖的活性驗(yàn)證及活性檢測(cè)用細(xì)胞的選擇

2.4.1 注射用鹿茸多肽對(duì)體外培養(yǎng)新生大鼠頭蓋骨成骨細(xì)胞增殖的影響 表1顯示，成骨細(xì)胞分離、培養(yǎng)與傳代方法同2.2.2。待細(xì)胞生長(zhǎng)至60%～70%貼壁后，用0.25%胰蛋白酶消化，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液吹打制成細(xì)胞懸液，第2代細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至3×104，接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μL，其中10孔加含10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)液(不含細(xì)胞)100μL作為對(duì)照，置37℃ 5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng) 12h。棄去培養(yǎng)液供試品組，用DMEM培養(yǎng)基稀釋樣品至 1.0mg/ml、0.25mg/ml、0.01mg/ml，每孔加入 200μL，每批供試品做 10孔，細(xì)胞對(duì)照組和空白對(duì)照組每孔分別加入DMEM培養(yǎng)基 200μL，置 37℃ 5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng) 72h，結(jié)束培養(yǎng)前4h取出細(xì)胞培養(yǎng)板吸取培養(yǎng)液，每孔加入0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH7.3)洗滌1次，然后每孔加入上述緩沖液(pH7.3)配制的 MTT［6］溶液30μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h。培養(yǎng)結(jié)束后，吸棄孔內(nèi) MTT溶液，每孔加入150μL的二甲基亞砜(DMSO)，震蕩培養(yǎng)10min，在酶標(biāo)儀用590nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度OD值。

2.4.2 注射用鹿茸多肽對(duì)體外培養(yǎng)成骨樣細(xì)胞MG-63增殖的影響 用含10%的胎牛血清DMEM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)MG-63細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶的消化液消化傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)至第3代，消化后收集到的細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至3×104，接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。給藥濃度、分組、培養(yǎng)時(shí)間同2.4.1。表2顯示，72h后在酶標(biāo)儀用590nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸收度OD值，比較各樣品與細(xì)胞對(duì)照間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1 注射用鹿茸多肽對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞增殖的影響(72h，n=10，x珋±s)

表2 注射用鹿茸多肽對(duì)體外培養(yǎng)MG-63細(xì)胞增殖的影響(72h，n=10，±s)

表2 注射用鹿茸多肽對(duì)體外培養(yǎng)MG-63細(xì)胞增殖的影響(72h，n=10，±s)

注:與細(xì)胞對(duì)照組比較:＊＊P ＜0.01，*P ＜0.05

組 別 給藥劑量 OD值細(xì)胞對(duì)照 200μL培養(yǎng)液0.175±0.032高 劑 量 1.00mg/ml 0.256 ±0.028＊＊中 劑 量 0.25mg/ml 0.250 ±0.023＊＊低 劑 量 0.01mg/ml 0.208±0.026*

2.4.3 活性檢測(cè)細(xì)胞的選擇 通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，注射用鹿茸多肽對(duì)原代培養(yǎng)的大鼠頭蓋骨成骨細(xì)胞和MG-63細(xì)胞均具有促增殖作用，由于MG-63細(xì)胞株穩(wěn)定、細(xì)胞間個(gè)體差異小、來(lái)源清楚、培養(yǎng)條件穩(wěn)定、培養(yǎng)更方便，故采用 MG-63細(xì)胞作為活性檢測(cè)的細(xì)胞株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.5 注射用鹿茸多肽活性檢測(cè)細(xì)胞密度優(yōu)化

表3顯示，用含10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整 MG-63細(xì)胞密度至 5 ×103、5 ×104、5 ×105，分別接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)72h得出不同細(xì)胞濃度下的吸光度OD值。

表3 不同密度MG-63細(xì)胞的生長(zhǎng)情況(72h，n=10，±s)

表3 不同密度MG-63細(xì)胞的生長(zhǎng)情況(72h，n=10，±s)

細(xì)胞密度 OD值5×1030.154±0.030 5×104 0.387±0.031 5×1051.576±0.048

通過(guò)數(shù)據(jù)分析可得出細(xì)胞濃度不同，其吸光度值也不同，5×103細(xì)胞密度過(guò)低，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，OD值偏低;5×105細(xì)胞密度過(guò)大，3d已經(jīng)長(zhǎng)滿單層抑制細(xì)胞生長(zhǎng)且OD較大，其中細(xì)胞密度為5×104時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，數(shù)據(jù)穩(wěn)定?？紤]到MTT檢測(cè)的線性范圍和加入注射用鹿茸多肽后的作用時(shí)間，所以選用此濃度范圍的5×104為細(xì)胞實(shí)驗(yàn)密度。

2.6 注射用鹿茸多肽活性檢測(cè)給藥濃度及培養(yǎng)時(shí)間的篩選

細(xì)胞按5×104個(gè)/孔接種到96孔培養(yǎng)板上，分別與不同濃度的注射用鹿茸多肽培養(yǎng)基和正常DMEM-aa 培養(yǎng)基共同培養(yǎng) 12h、24h、48h、72h、96h、120h、144h。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別取10個(gè)培養(yǎng)孔，在各時(shí)間點(diǎn)小心吸棄培養(yǎng)液，用 PBS洗滌1次，每孔加30μL MTT(5mg/ml)，繼續(xù)孵育 4h后終止培養(yǎng)。吸棄上清，每孔再加入150μL DMSO振蕩培養(yǎng)10 min。表4顯示，在酶標(biāo)儀用590nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸收度OD值，取其均值。圖2顯示，以時(shí)間為橫坐標(biāo)、OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

表4顯示，接種后所測(cè)得的細(xì)胞剛接種后12h、24h、48hOD值變化不大，到第3天～第6天細(xì)胞OD值逐漸增加。12h、24h、48hOD值變化不大，甚至OD值下降，分析原因可能由于消化和傳代導(dǎo)致部分細(xì)胞受損傷死亡，使細(xì)胞數(shù)目減少，但48h～72h開始細(xì)胞數(shù)目逐漸增加。進(jìn)入到對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，考慮到一般細(xì)胞培養(yǎng)3d需要換液才能維持培養(yǎng)基的PH值及營(yíng)養(yǎng)，為方便實(shí)驗(yàn)操作，選擇72h為最佳測(cè)定時(shí)間。

表4 不同濃度注射用鹿茸多肽作用于MG-63細(xì)胞的生長(zhǎng)情況(n=10，±s)

表4 不同濃度注射用鹿茸多肽作用于MG-63細(xì)胞的生長(zhǎng)情況(n=10，±s)

注:與細(xì)胞對(duì)照組比較:＊＊P ＜0.01，*P ＜0.05

藥物濃度(mg/ml)12h 24h(1d) 48h(2d) 72h(3d) 96h(4d) 120h(5d) 144h(6d)2.50 0.116±0.022＊＊ 0.082±0.013* 0.082±0.025＊＊ 0.218±0.033＊＊ 0.305±0.021* 0.721±0.057 0.909±0.042*0.042 0.253±0.026 0.680±0.033 0.827±0.040 1.00 0.105±0.024＊＊ 0.096±0.026＊＊ 0.099±0.035＊＊ 0.242±0.031＊＊ 0.351±0.021＊＊ 0.799±0.042＊＊ 1.030±0.062＊＊0.50 0.101±0.032＊＊ 0.091±0.022＊＊ 0.092±0.036＊＊ 0.227±0.051＊＊ 0.370±0.049＊＊ 0.825±0.072＊＊ 1.019±0.078 0.25 0.103±0.033＊＊ 0.083±0.022* 0.095±0.041＊＊ 0.251±0.027＊＊ 0.397±0.042＊＊ 0.774±0.039＊＊ 0.975±0.055＊＊0.10 0.102±0.037＊＊ 0.056±0.042* 0.073±0.026* 0.258±0.048＊＊ 0.384±0.044＊＊ 0.837±0.059＊＊ 1.021±0.048＊＊0.01 0.090±0.012* 0.056±0.022 0.077±0.027＊＊ 0.198±0.036* 0.334±0.062＊＊ 0.768±0.056＊＊ 0.797±0.054對(duì)照組 0.073±0.047 0.066±0.031 0.059±0.024 0.160±

圖2 不同濃度骨肽注射液作用于MG-63細(xì)胞的生長(zhǎng)情況

圖2顯示，0.1mg/ml劑量對(duì)細(xì)胞促增殖作用較好，因此選擇0.1mg/ml、72h為最佳刺激濃度和最佳測(cè)定時(shí)間。

2.7 注射用鹿茸多肽活性檢測(cè)重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

表5顯示，細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，消化、調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個(gè)/孔接種至96孔板，置37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁4h后給注射用鹿茸多肽，培養(yǎng)72h后進(jìn)行MTT檢測(cè)。對(duì)110608供試品不同時(shí)間重復(fù)試驗(yàn)5次。

表5 注射用鹿茸多肽對(duì)MG-63細(xì)胞增殖的影響(72h，±s，n=10)

表5 注射用鹿茸多肽對(duì)MG-63細(xì)胞增殖的影響(72h，±s，n=10)

注:與細(xì)胞對(duì)照組比較:*P＜0.05，RSD值=11.50%

對(duì)照組 注射用鹿茸多肽OD值第1次 0.249±0.027 0.302±0.032*第2次 0.256±0.036 0.306±0.033*第3次 0.254±0.037 0.310±0.041*第4次 0.254±0.038 0.309±0.029*第5次 0.248±0.036 0.303±0.041*

通過(guò)以上數(shù)據(jù)可知，該方法重復(fù)性好，準(zhǔn)確性高，可以作為注射用鹿茸多肽生物學(xué)活性的常規(guī)檢查方法。

3 討論

采用Ⅰ型膠原酶梯度培養(yǎng)法分離新生乳鼠頭蓋骨成骨細(xì)胞，得到的成骨細(xì)胞純度高、成活率高，且此法操作簡(jiǎn)單，可以作為新生乳鼠頭蓋骨成骨細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)方法。細(xì)胞生長(zhǎng)密度大小對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有很大影響，密度過(guò)大會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞在一定時(shí)間內(nèi)成簇疊加生長(zhǎng)，密度足夠大時(shí)會(huì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，密度過(guò)低細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，MTT檢測(cè)時(shí)吸光度值偏低，影響評(píng)價(jià)藥物作用。藥物濃度較大，細(xì)胞生長(zhǎng)速率較快，細(xì)胞數(shù)目足夠多時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡;藥物濃度較低，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，MTT檢測(cè)時(shí)吸光度值偏低，所以給藥濃度較低或密度較低均會(huì)影響評(píng)價(jià)藥物作用。細(xì)胞生長(zhǎng)可分為滯留期、對(duì)數(shù)期、生長(zhǎng)停止期3個(gè)階段，給藥培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，使細(xì)胞達(dá)到生長(zhǎng)停止期甚至死亡，MTT檢測(cè)吸光度值明顯偏低;給藥培養(yǎng)時(shí)間過(guò)短，未達(dá)到對(duì)數(shù)期則同樣會(huì)使MTT檢測(cè)吸光度值偏低，影響評(píng)價(jià)藥物作用。

目前在中藥注射劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中安全性檢查項(xiàng)目均采用生物檢定，而中藥生物活性或生物效價(jià)測(cè)定項(xiàng)目卻寥寥無(wú)幾，雖有人工察香、水蛙等中藥使用了生物活性測(cè)定法，但絕大多數(shù)中藥制劑主要使用理化分析方法。近年來(lái)，基于歐美藥品管理部門認(rèn)為，草藥的質(zhì)量穩(wěn)定性單靠測(cè)定已知的有效成分是不夠的，因?yàn)椴菟幖捌渲苿┦且云湔w作為有效物質(zhì)。因此，中藥的指紋圖譜檢測(cè)方法的推廣，使中藥質(zhì)量控制從單一指標(biāo)成分分析向綜合成分分析的方向發(fā)展。但脫離成分的有效活性和安全活性來(lái)考慮指標(biāo)成分含量測(cè)定或多種成分的指紋圖譜檢測(cè)方法，雖然分析方法先進(jìn)，但仍具有一定的局限性。因此，國(guó)內(nèi)外基本上都將指紋圖譜的研究和應(yīng)用限定在鑒別范疇，而采用生物檢定的方法與主要活性成分理化分析方法相結(jié)合的中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，更能全面綜合地保證藥品的安全性、有效性和質(zhì)量可控性。本課題以中藥鹿茸制成的注射用鹿茸多肽為研究對(duì)象，初步探討了應(yīng)用主要藥效學(xué)指標(biāo)作為生物活性檢測(cè)方法的可行性。通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明，可以選擇合適的中藥主要藥效學(xué)試驗(yàn)方法，開展生物活性測(cè)定方法和測(cè)定限值的研究。

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