人鼻咽癌細(xì)胞株中表皮生長(zhǎng)因子受體蛋白表達(dá)與西妥昔單抗抑制率的相關(guān)性研究

劉靜 王斌斌 劉斐葉 左強(qiáng)

（南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院腫瘤中心，廣東 廣州 510515）

表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因定位于染色體7p12[1]。EGFR在人類部分腫瘤中呈高表達(dá)，其介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）中EGFR高表達(dá)，并且這種高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)[2]。西妥昔單抗（cetuximab）是一種人／鼠嵌合型IgG單克隆抗體，可與細(xì)胞表面EGFR特異性結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性阻斷表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）和其他配體如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－α（transforming growth factor-α，TGF-α）的結(jié)合，從而阻斷EGFR依賴的腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲以及血管生成等生物學(xué)效應(yīng)。本研究應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)人NPC細(xì)胞株CNE-1、CNE-2、HONE-1、C-666、SUNE-1、5-8F 以 及HNE-17種細(xì)胞株中EGFR蛋白表達(dá)水平，用MTT法檢測(cè)西妥昔單抗對(duì)細(xì)胞株的抑制率，并探討兩者的相關(guān)性，了解檢測(cè)EGFR蛋白表達(dá)水平是否能夠判斷西妥昔單抗治療NPC的療效。

1 資料與方法

1.1 研究材料 西妥昔單抗由德國(guó)Merck公司提供，β-actin一抗與EGFR一抗購自武漢Boster公司，人NPC細(xì)胞株CNE-1、CNE-2、HONE-1、C-666、SUNE-1、5-8F以及 HNE-1由廣州博川生物科技有限公司提供。采用RPMI 1640培養(yǎng)液。

1.2 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)EGFR蛋白表達(dá)水平 按常規(guī)方法進(jìn)行。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞抑制率 按常規(guī)方法進(jìn)行。用Bio-Tek酶標(biāo)儀分析490 nm處OD值。細(xì)胞抑制率＝（加藥組OD值－空白對(duì)照組OD值）／（正常對(duì)照組OD值－空白對(duì)照組OD值）×100%

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用方差分析和雙變量相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié) 果

2.1 不同NPC細(xì)胞株中EGFR蛋白的表達(dá)差異不同NPC細(xì)胞株的EGFR表達(dá)水平有顯著差異（F＝1748.784，P＜0.001），其中以5-8F細(xì)胞株中EGFR表達(dá)水平最高，顯著高于其他6種細(xì)胞株（P＜0.001）；其次為SUNE-1，見圖1～2。

圖1 不同NPC細(xì)胞株EGFR蛋白表達(dá)

圖2 不同NPC細(xì)胞株EGFR蛋白表達(dá)水平

2.2 西妥昔單抗對(duì)不同NPC細(xì)胞的抑制率 1500 μg／mL濃度時(shí)，西妥昔單抗對(duì)不同NPC細(xì)胞株的抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝5.942，P＝0.003），其中以對(duì)5-8F細(xì)胞株的抑制率最高，對(duì) HONE-1抑制率最低；1800μg／mL濃度時(shí)，西妥昔單抗對(duì)不同NPC細(xì)胞的抑制率無顯著差異（F＝2.565，P＝0.069），其中以對(duì)CNE-1細(xì)胞抑制率最高。西妥昔單抗高濃度組中NPC細(xì)胞的抑制率雖均高于低濃度組，但兩組之間無顯著差異（P＞0.05）。見表1、圖3。

表1 西妥昔單抗不同濃度時(shí)對(duì)不同NPC細(xì)胞株的抑制率（）

表1 西妥昔單抗不同濃度時(shí)對(duì)不同NPC細(xì)胞株的抑制率（）

細(xì)胞株類型 西妥昔單抗（1500μg／mL） 西妥昔單抗（1800μg／mL） F值 P值288 CNE-2 43.90±15.06 56.16±20.16 0.356 0.583 HNE-1 41.45±5.13 68.33±3.39 1.132 0.3475-8F 47.88±3.57 51.56±4.84 0.132 0.735 HONE-1 15.27±7.31 66.81±2.80 1.490 0.289 C666 43.67±2.23 55.48±2.94 0.587 0.486 SUNE-1 45.01±1.52 64.96±1.62 0.023 0.888 F 值 5.942 2.565 P值 0.003 0.CNE-1 40.71±10.16 72.39±6.15 1.498 0.069

圖3 西妥昔單抗不同濃度時(shí)對(duì)不同NPC細(xì)胞株的抑制率

2.3 EGFR表達(dá)水平與細(xì)胞抑制率相關(guān)性研究1500μg／mL濃度時(shí)，西妥昔單抗的細(xì)胞抑制率與EGFR蛋白表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)（r＝0.444，P＝0.044）；1800μg／mL濃度時(shí)西妥昔單抗的細(xì)胞抑制率與EGFR蛋白表達(dá)水平則呈顯著負(fù)相關(guān)（r＝-0.468，P＝0.032）。

3 討 論

西妥昔單抗治療EGFR高表達(dá)的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌、局部晚期及復(fù)發(fā)／轉(zhuǎn)移頭頸部鱗癌（SCCHN），療效好[3－4]。最近，研究者們認(rèn)為，表達(dá)野生型 K-ras基因的結(jié)直腸癌患者采用西妥昔單抗和化療聯(lián)合治療療效較好，而K-ras基因?yàn)橥蛔冃偷幕颊咴诨熁A(chǔ)上應(yīng)用西妥昔單抗并無額外益處。

NPC是我國(guó)最常見的頭頸部惡性腫瘤，好發(fā)于中國(guó)南方各省及東南亞地區(qū)，其病因包括EB病毒、遺傳易感性、多種癌基因和抑癌基因的相互作用以及環(huán)境和飲食因素[5－6]。NPC的 EGFR 表達(dá)率為90%～100%。Ma等[7]報(bào)告，EGFR表達(dá)與未分化NPC患者的不良預(yù)后相關(guān)，提示EGFR表達(dá)可作為判斷NPC患者預(yù)后的一個(gè)指標(biāo)。K-ras癌基因被認(rèn)為是細(xì)胞惡變過程中起引發(fā)作用的基因，在NPC發(fā)生和發(fā)展中K-ras基因過表達(dá)起重要作用，而非基因突變[8]。故無法通過檢測(cè)K-ras基因狀態(tài)來決定是否應(yīng)用西妥昔單抗。目前研究尚未證實(shí)EGFR基因或蛋白檢測(cè)可預(yù)測(cè)EGFR抑制劑的療效。

本研究顯示，不同NPC細(xì)胞株均存在EGFR蛋白表達(dá)，其中以5-8F最高，CNE-1最低；西妥昔單抗對(duì)不同NPC細(xì)胞株生長(zhǎng)均有一定程度抑制作用，其中1500μg／mL濃度對(duì)5-8F抑制率最高；1800 μg／mL濃度對(duì)CNE-1抑制率最高，而對(duì)5-8F抑制率最低。通過對(duì)EGFR蛋白表達(dá)水平與細(xì)胞抑制率之間的相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)西妥昔單抗?jié)舛葹?500μg／mL時(shí)，兩者之間呈顯著正相關(guān)（r＝0.444，P＝0.044），但當(dāng)濃度增加至1800μg／mL，兩者之間呈顯著負(fù)相關(guān)（r＝-0.468，P＝0.032）。這一結(jié)果提示，NPC細(xì)胞中EGFR蛋白表達(dá)水平與西妥昔單抗細(xì)胞抑制率之間并無相關(guān)性，在NPC治療選擇過程中，EGFR蛋白表達(dá)水平并不能作為預(yù)測(cè)西妥昔單抗療效的指標(biāo)。

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