Rho激酶抑制劑Y－27632對(duì)人U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力的影響

李 濤 薛進(jìn)展 范 波 楊晉生 古選民 張 峰 鄭鳳琴 王蘚茹

河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院 洛陽(yáng) 471003

膠質(zhì)瘤的發(fā)病率約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤的40%，呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，手術(shù)全切除率低，復(fù)發(fā)率高，多數(shù)病理類型對(duì)化療、放療不敏感。因此，能否抑制膠質(zhì)瘤的局部侵潤(rùn)成為改善膠質(zhì)瘤預(yù)后的關(guān)鍵。近年來發(fā)現(xiàn)細(xì)胞Rho／Rock信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)胞骨架重組以及惡性腫瘤細(xì)胞的侵潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等方面具有重要的調(diào)節(jié)作用［1］。Rho家族是Ras超家族小分子量G蛋白的成員，是一組分子量為20～25KD的鳥苷酸核結(jié)合蛋白，具有GTP酶活性。異?；罨腞ho家族亦具有啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞無限增殖、浸潤(rùn)和侵襲轉(zhuǎn)移的能力。其最重要的下游因子是Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶（Rho associated coiled coil forming protein kinase），簡(jiǎn)稱ROCK或Rho激酶。本研究用Rho激酶特異性抑制劑Y－27632作用于體外培養(yǎng)的U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞，探討Rho／ROCK信號(hào)系統(tǒng)在U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)周圍組織侵潤(rùn)中的作用。

1 材料與方法

1.1材料超凈工作臺(tái)（蘇州凈化集團(tuán)空氣技術(shù)公司），二氧化碳培養(yǎng)箱（Harris，美國(guó)），倒置顯微鏡（Nikon，日本），DMEM 培養(yǎng)基（Sigma，美國(guó)），胰蛋白酶 （Sigma，美國(guó)），胎牛血清（杭州四季青公司產(chǎn)品），Matrigel基質(zhì)膠（Sigma，美國(guó)），人U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞株（中科院上海細(xì)胞庫(kù)），Transwell 24孔培養(yǎng)板（corstor corning，美國(guó)），Y－27632（SantaCruz公司），Rho－Kinase活性測(cè)定試劑盒（Cyelex），DMSO（Sigma，美國(guó)）。

1.2實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組0mol／L（定義為A組）與實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組中 Y－27632濃度分別為10、25、50mol／L組（分別定義為B、C、D、E），每組6例，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)用含10%胎牛血清、100U青霉素、100U鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)人U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞系。

1.4 U87細(xì)胞體外浸潤(rùn)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，倒去細(xì)胞培養(yǎng)液，用0.25%胰酶消化細(xì)胞1min，然后加入10 mL培養(yǎng)液，將細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液（1×106）200μL 分別接種在直徑6.5mm（Costar，Cambridge，MA）上室內(nèi)，上室內(nèi)用質(zhì)量濃度為0、10、25、50μmol／L的Y－27632處理，實(shí)驗(yàn)所用藥物質(zhì)量濃度不影響細(xì)胞生長(zhǎng)活性。將已接種細(xì)胞的Transwell培養(yǎng)板再次培養(yǎng)10h（37℃、5%CO2）。Transwell小室底部帶有多聚碳酸脂膜，膜上均勻分布有直徑8μm的小孔，并鋪有Matrigel基質(zhì)膠，下室內(nèi)加入完全培養(yǎng)基。U87細(xì)胞將通過侵襲Matrigel基質(zhì)膠遷移、穿過多孔濾膜，而后附著在濾膜另一面。培養(yǎng)后用0.1%結(jié)晶紫染色附著在濾膜下室面的U87細(xì)胞，再用33%醋酸脫色，將結(jié)晶紫完全洗脫下來，洗脫液可在酶標(biāo)儀上490 nm測(cè)其吸光度值（OD值），從而間接反映細(xì)胞數(shù)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)以（s）表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析（ANOVA），用Dunnett t檢驗(yàn)法比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

Transwell小室測(cè)定體外培養(yǎng)U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵潤(rùn)能力。U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞分別用0、10、25、50μmol／L的Y－27632處理后培養(yǎng)12h。Transwell小室下室側(cè)細(xì)胞經(jīng)結(jié)晶紫染色，然后把結(jié)晶紫完全洗脫下來。洗脫液用酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)其OD值，間接反應(yīng)細(xì)胞數(shù)。其OD值分別為（0.2875±0.0526）、（0.2239±0.0466）、（0.1748±0.0238）、（0.1275±0.0346）。其中當(dāng) Y－27632濃度為25μmol／L時(shí)其OD值與對(duì)照組經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），50μmol／L時(shí)其OD值與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。25μmol／L組與50μmol／L組之間經(jīng)t檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、圖1。

表1 2組OD值統(tǒng)計(jì)學(xué)比較

圖1 不同濃度的Y－27632對(duì)U87細(xì)胞侵襲能力的抑制（10×10）

3 討論

ROCK是一種絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，有兩種亞型ROKα（ROCKⅡ）和p160ROCK （ROKβ或 ROCKⅠ），可以被GTP結(jié)合狀態(tài)的Rho蛋白所激活，進(jìn)而磷酸化其底物，在各種類型的細(xì)胞活動(dòng)中介導(dǎo)肌動(dòng)蛋白纖維張力和局部黏著斑的形成。該類酶的過度表達(dá)能通過與上皮鈣黏附素（E－cadherin）及其介導(dǎo)的細(xì)胞因子間的相互作用破壞細(xì)胞間的粘附，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。Rho激酶也能通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶促進(jìn)基質(zhì)降解和腫瘤轉(zhuǎn)移。在此過程中ROCKⅠ與ROCKⅡ通過不同的機(jī)制影響細(xì)胞骨架的形成和基質(zhì)降解［2］。Y－27632是Rho激酶活性的特異性抑制劑，對(duì)Rho激酶的抑制特異性較其他蛋白激酶如cAMP依賴的蛋白激酶以及肌球蛋白輕鏈激酶等高200倍，并呈濃度依賴性［3］，對(duì)ROCKⅠ和ROCKⅡ抑制的 Ki值分別為0.22和0.30μmol／L［4］。

在以往的實(shí)驗(yàn)中，我們報(bào)道了由0～100μmol／L不同質(zhì)量濃度的Rho激酶抑制劑Y－27 632處理U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞后，U87細(xì)胞生長(zhǎng)活性抑制不明顯，而ROCK活性逐漸抑制的結(jié)果［5］。本實(shí)驗(yàn)在Transwell小室底部鋪上Matrigel基質(zhì)膠，進(jìn)一步模擬體內(nèi)環(huán)境，觀察Y－27 632對(duì)U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)周圍組織侵襲能力的影響。在本實(shí)驗(yàn)中50μmol／L時(shí)Y－27 632對(duì)對(duì)照組的抑制結(jié)果與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與作者以前的實(shí)驗(yàn)相比差異更為顯著，可能的原因有：（1）半透膜增厚，細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力進(jìn)一步抑制；（2）在較高濃度下，細(xì)胞的對(duì)周圍基質(zhì)的破壞受到抑制更加明顯。通過劃痕實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果提示在高濃度的Y－27 632對(duì)U87細(xì)胞對(duì)周圍基質(zhì)降解的抑制作用明顯，并且這一作用有賴于對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶的調(diào)節(jié)。因設(shè)計(jì)所限，本實(shí)驗(yàn)未能將“不同濃度Y－27 632對(duì)遷移的影響”這一因素從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中去除，有待于改進(jìn)。最終的結(jié)果可能是這兩種機(jī)制共同受到抑制形成的。

由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境高度復(fù)雜，對(duì)其調(diào)節(jié)的環(huán)節(jié)也同樣復(fù)雜，故在體外很難準(zhǔn)確模擬膠質(zhì)瘤在體內(nèi)的侵潤(rùn)及轉(zhuǎn)移，臨床的大量資料表明，腫瘤細(xì)胞的侵襲有兩個(gè)路徑：（1）沿著有髓神經(jīng)纖維束進(jìn)行遷移，這是膠質(zhì)瘤細(xì)胞沿胼胝體和前交叉遷移的主要路徑，這樣腫瘤可以從一側(cè)半球轉(zhuǎn)移到對(duì)側(cè)大腦半球。（2）腫瘤細(xì)胞沿著血管基底膜途徑侵襲。新生血管的形成是瘤細(xì)胞擴(kuò)散的必要條件，如果腫瘤組織不能獲得額外的血流供應(yīng)則其侵襲性不會(huì)超過2cm遠(yuǎn)的距離，瘤組織僅沿血管外膜侵襲而不破壞血管本身，但可以增加血腦屏障的通透性。其中沿纖維束擴(kuò)散是高級(jí)別膠質(zhì)瘤最主要的侵襲方式［6－7］。瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力應(yīng)該包括膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷徙能力和對(duì)周圍基質(zhì)的破壞者兩方面，在這一過程中所發(fā)生的復(fù)雜反應(yīng)的機(jī)制還未完全闡明，其中既包括瘤細(xì)胞對(duì)周圍組織的作用，也包括外界組織對(duì)瘤細(xì)胞反應(yīng)的互動(dòng)過程，通過現(xiàn)有的技術(shù)在體外難以達(dá)到。

本實(shí)驗(yàn)初步模擬了影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞移行障礙和存在周圍基質(zhì)阻礙兩方面的基本因素，觀察Rho激酶抑制劑對(duì)其影響結(jié)果。Rho激酶抑制劑Y－27 632對(duì)U87細(xì)胞的浸潤(rùn)能力有明顯抑制這一結(jié)果提示：Rho／Rock細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和對(duì)周圍組織的浸潤(rùn)關(guān)系密切，我們可以以此為切入點(diǎn)來逐步揭示膠質(zhì)瘤的侵潤(rùn)及轉(zhuǎn)移機(jī)制，為臨床治療提供基礎(chǔ)。

［1］Eleni Makrodouli，Eftychia Oikonomou，Michal Koc，et al.BR AF and RAS oncogenes regulate Rho GTPase pathways to mediate migration and invasion properties in human colon cancer cells：a comparative study［J］.Mol Cancer，2011，10：118.

［2］Oellers P，Schr er U，Senner V，et al.ROCKs are expressed in brain tumors and are required for glioma－cell migration on myelinated axons［J］.GLIA，2009，57：499－509.

［3］akayama M，Amano M，Katsumi A，et al.Rho－kinase and myosinⅡactivities are required for cell type and environment specific migration［J］.Cenes Cells，2005，10：107－117.

［4］Ishizaki T，UehataM，Tamechika I，et al.Pharmacological properties of Y－27632，a specific inhibitor of Rho－associated kinases［J］.Mol Pharmacol，2000，57（5）：976－983.

［5］薛進(jìn)展，范波，邢群智，等.Rho激酶抑制劑Y－27632對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與遷移能力的影響［J］.河南科技大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2010，28：247－252.

［6］蔣傳路，江濤，李永利，等 .膠質(zhì)瘤的侵襲性生長(zhǎng)與手術(shù)策略［J］.中華神經(jīng)外科雜志，2004，20：510－512.

［7］Huang XN，F(xiàn)u J，Wang WZ.The effects of fasudil on the permeability of the rat blood－brain barrier and blood－spinal cord barrier following experimental autoimmune encephalomyelitis［J］.J Neuroimmunol，2011，239（1－2）：61－617.