膠紅酵母固定化方法研究

于梅艷

(中州大學(xué)化工食品學(xué)院，鄭州450044)

膠紅酵母固定化方法研究

于梅艷

(中州大學(xué)化工食品學(xué)院，鄭州450044)

研究膠紅酵母固定化方法，并測(cè)定所得固定化細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度和通透性，對(duì)固定化方法進(jìn)行初步篩選;研究磷酸緩沖溶液對(duì)固定化細(xì)胞強(qiáng)度的影響，最終得到目的固定化方法。試驗(yàn)表明:CA－活性炭(C)復(fù)合凝膠包埋所得固定化細(xì)胞，經(jīng)0.6%聚乙烯亞胺(PEI)強(qiáng)化12 h，再經(jīng)1%的戊二醛強(qiáng)化3 h后，機(jī)械強(qiáng)度大大提高，能耐磷酸緩沖液。

膠紅酵母;細(xì)胞固定化;機(jī)械強(qiáng)度;通透性

本文主要采用海藻酸鈣、海藻酸鋁、明膠、卡拉膠、聚乙烯醇、活性炭等載體固定化膠紅酵母，選擇合適的細(xì)胞固定化方法，以得到機(jī)械強(qiáng)度高、細(xì)胞通透性好且酶活保留率高的固定化細(xì)胞，最終用于生物轉(zhuǎn)化技術(shù)。

1.材料和方法

1.1 酵母菌株

膠紅酵母由鄭州大學(xué)新藥研發(fā)中心篩選。

1.2 材料

1.2.1 培養(yǎng)基

蛋白胨為0.2%，玉米漿為2%，甘油為3%。

1.2.2 原料及試劑

玉米漿由安陽(yáng)第一制藥廠提供。瓊脂粉、蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、戊二醛、海藻酸鈉及其他試劑均為分析純。顆粒狀活性炭、聚乙烯亞胺為工業(yè)級(jí)。明膠、卡拉膠為食品級(jí)。磷酸緩沖溶液自制，轉(zhuǎn)化底物自制。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)細(xì)胞

接種量為1環(huán)/20 mL，放入搖床，生長(zhǎng)溫度為32℃，搖床轉(zhuǎn)速為210 r/min，培養(yǎng)40 h。

1.3.2 固定化方法

細(xì)胞固定化按文獻(xiàn)［1－4］方法進(jìn)行。

a.海藻酸鈉包埋法

用生理鹽水配制一定濃度的海藻酸鈉(CA)溶液20 mL，煮沸使其充分溶解，冷卻至48℃?zhèn)溆?取適量濕菌體加入生理鹽水調(diào)制成均勻的菌懸液;將菌懸液與海藻酸鈉溶液混合，并充分搖勻;將20 mL 0.05 mol/L氯化鈣溶液移入一個(gè)無(wú)菌三角瓶中;將海藻酸鈉菌體混懸液移入無(wú)菌注射器中，適度加力，將其滴入0.05 mol/L的氯化鈣溶液中;滴完后傾去溶液，加入適量無(wú)菌去離子水沖洗1次;重新加入適量0.05 mol/L氯化鈣溶液4℃平衡過夜。

b.海藻酸鋁包埋法

只需把方法a中氯化鈣換為氯化鋁即可。

c.明膠－戊二醛復(fù)合法

將明膠配制成濃度為6%的生理鹽水溶液，煮沸溶解，冷卻至48℃左右，與生理鹽水調(diào)制的菌體懸浮液在不高于45℃的條件下混合均勻，加入1%戊二醛交聯(lián)凝固，置于4℃以下的冰箱中4 h左右，取出切塊后浸泡于0.5%戊二醛中于4℃下硬化一段時(shí)間，將固定化細(xì)胞濾出、水洗后備用。

d.卡拉膠包埋法

在4.5 g卡拉膠中加入150 mL生理鹽水，沸水浴溶解后于50℃水浴;取25 g酵母菌體，加入75 mL生理鹽水，攪拌均勻后升溫至40℃，加入3 mL甲苯，立即與卡拉膠溶液混合，倒入淺盤中冷卻，加2.25%KCl，硬化 3 h，傾去 KCl，洗滌，切成 5 mm 小塊冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

e.卡拉膠－明膠復(fù)合包埋法

卡拉膠的濃度設(shè)定為3%，明膠的濃度作以下幾個(gè)平衡:3%、4%、5%、6%，將以上兩種包埋劑充分溶解并混勻，其他方法同d，得到5 mm見方小塊于冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

f.聚乙烯醇(PVA)－海藻酸鈉－活性炭(C)復(fù)合凝膠包埋法

PVA 10 g，適量(2% －4%)海藻酸鈉，蒸餾水100 mL，適量(0－2%)活性炭，加熱煮沸，PVA冷卻到室溫;硼砂3 g，氯化鈣4 g，各加水50 mL，分開溶化后，混合，充分?jǐn)嚢璩赡z狀;將收集的一定量的菌體加入到PVA中攪拌均勻。將混有菌體的PVA用注射器勻速滴入硼砂和氯化鈣混合液中，充分反應(yīng)后，濾出，洗凈，即得4 mm左右均勻小珠。

1.3.3 機(jī)械強(qiáng)度測(cè)定方法

a.砝碼加壓法［5］

取幾個(gè)大小均勻的顆粒，上面加蓋一個(gè)載玻片，在其上加壓砝碼至壓扁不碎，平均每個(gè)顆粒的砝碼克數(shù)記為顆粒的機(jī)械強(qiáng)度。

b.振蕩法

取一定量的固定化細(xì)胞，在磷酸緩沖溶液中，于150 r/min上搖床震蕩，定時(shí)觀察其顆粒的變化。

1.3.4 固定化細(xì)胞耐磷酸緩沖溶液性的測(cè)定

在磷酸緩沖溶液中加入一定量的包埋顆粒靜置過夜，觀察顆粒的變化情況;上搖床培養(yǎng)再觀察顆粒的變化情況。

1.3.5 固定化細(xì)胞通透性測(cè)定方法

利用固定化細(xì)胞的生物轉(zhuǎn)化的速率來(lái)判定。轉(zhuǎn)化率為50%左右所需時(shí)間來(lái)表示，時(shí)間越少表示細(xì)胞通透性越好。

2.結(jié)果與討論

2.1 海藻酸鈉與氯化鈣濃度的影響

鈣離子是決定固定化細(xì)胞機(jī)械強(qiáng)度的重要因素，隨著鈣離子濃度的增加，固定化酵母的強(qiáng)度增加，較低的海藻酸鈉濃度使凝膠相對(duì)滲透性能好，有利于底物進(jìn)入和產(chǎn)物排出。本試驗(yàn)用海藻酸鈉固定化紅酵母細(xì)胞，海藻酸鈉的濃度分別為2%、4%、6%，氯化鈣溶液的濃度分別為2%、3%、4%。

從表1的結(jié)果可以看出選擇較低的海藻酸鈉濃度(4%左右)和較高的氯化鈣濃度(4%左右)形成的凝膠固定化效果較好，機(jī)械強(qiáng)度高，轉(zhuǎn)化底物時(shí)轉(zhuǎn)化率到達(dá)50%所需時(shí)間較短。

表1 藻酸鈉與氯化鈣濃度對(duì)固定化細(xì)胞的影響

2.2 固定化材料的選擇

2.2.1 各種方法固定化細(xì)胞的強(qiáng)度測(cè)定

a.耐壓性能測(cè)試

各取若干粒不同方法固定化的細(xì)胞，平放于玻璃板上，用紙覆蓋，逐漸增加砝碼的重量，并觀察細(xì)胞顆粒受壓后的完整情況，以不引起顆粒破碎而使用的最大砝碼重量來(lái)衡量細(xì)胞顆粒的機(jī)械強(qiáng)度，表2可以看出10%PVA－4%CA的耐壓性能最好，為120 g/粒。

表2 不同固定化細(xì)胞的耐壓性能

b.耐振蕩性能測(cè)試

各取若干粒不同方法固定化的細(xì)胞，置于pH6.0的磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖溶液中，而后上搖床振蕩，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min，觀察它的耐振蕩性能。從表3可以看出用卡拉膠、明膠和卡拉膠－明膠固定化的細(xì)胞均在0.5 h左右完全破碎，呈糊狀，但用CA、PVA－CA和PVA－CA－C固定化的細(xì)胞1 h左右顆粒才出現(xiàn)破裂且沒有完全破碎，這說(shuō)明PVA－CA，PVA－CA－C復(fù)合凝膠固定化的細(xì)胞耐振蕩性能稍好，但也不能耐磷酸緩沖液，在磷酸緩沖液中浸泡一會(huì)幾乎就不呈顆粒。

表3 不同固定化細(xì)胞的耐振蕩性能

2.3 活性炭用量的影響

活性碳的用量對(duì)固定化細(xì)胞的通透性有一定影響，用CA－C－PVA包埋固定化細(xì)胞，活性炭的濃度為0、0.5%、1%、2%，測(cè)定轉(zhuǎn)化率為50%時(shí)的轉(zhuǎn)化時(shí)間，及其顆粒的耐壓性能，結(jié)果見表4。50%所需時(shí)間。

表4 活性炭對(duì)包埋顆粒通透性和機(jī)械強(qiáng)度的影響

由表4可知加活性炭的反應(yīng)速率明顯高于不加活性炭的包埋顆粒，但隨著活性炭的增加顆粒的機(jī)械強(qiáng)度逐步減小，故活性炭的用量也不能太多，選擇0.5%。

2.4 .固定化細(xì)胞對(duì)磷酸緩沖溶液耐受性研究

據(jù)文獻(xiàn)［4］報(bào)道，用聚乙烯亞胺溶液來(lái)處理海藻酸鈣凝膠，分別考察了聚乙烯亞胺－戊二醛交聯(lián)強(qiáng)化法來(lái)提高凝膠顆?？沽姿猁}的能力，發(fā)現(xiàn)經(jīng)強(qiáng)化的固定化細(xì)胞的抗磷酸鹽能力、機(jī)械強(qiáng)度均得到了提高，并且酶活力沒有變化，操作穩(wěn)定性較好。

本試驗(yàn)分別用4%CA、4%CA－0.5%C和4%CA－10%PVA－0.5%C固定化紅酵母細(xì)胞，再經(jīng)0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0% 聚乙烯亞胺處理12 h，再用1%的戊二醛浸泡強(qiáng)化3 h，而后測(cè)其機(jī)械強(qiáng)度和轉(zhuǎn)化效果。試驗(yàn)結(jié)果見表5和圖1。

固定化細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度直接影響著其使用壽命，機(jī)械強(qiáng)度越大，在進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化過程中越耐磨，其使用壽命越長(zhǎng)。表5的結(jié)果表明，經(jīng)PEI強(qiáng)化的固定化細(xì)胞，其機(jī)械強(qiáng)度有了明顯提高，其中PEI對(duì)4%CA－0.5%C固定化細(xì)胞強(qiáng)度作用最明顯，經(jīng)1%PEI強(qiáng)化后，其機(jī)械強(qiáng)度竟達(dá)到260.1g/粒，是未強(qiáng)化時(shí)的14.2倍。

表5 不同濃度PEI強(qiáng)化固定化細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度

圖1的結(jié)果表明，PEI濃度對(duì)固定化細(xì)胞通透性有影響，隨著PEI濃度的增大，固定化細(xì)胞的通透性有明顯降低，但0.6%PEI強(qiáng)化4% －0.5%C固定化細(xì)胞的通透性較好，轉(zhuǎn)化效果與游離細(xì)胞相當(dāng)，在磷酸緩沖溶液中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化后，其固定化細(xì)胞顆粒完好無(wú)損，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，顆粒仍完好，可反復(fù)使用。

圖1 PEI濃度對(duì)不同固定化細(xì)胞通透性的影響

3.結(jié)論

本文對(duì)細(xì)胞固定化方法進(jìn)行研究，用海藻酸鈣(CA)、海藻酸鋁、明膠、卡拉膠、卡拉－明膠、聚乙烯醇(PVA)－CA和聚乙烯醇－活性炭－CA復(fù)合凝膠分別對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行固定化，并通過測(cè)定各種方法所得固定化細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度和通透性，對(duì)固定化方法進(jìn)行初步篩選;研究磷酸緩沖溶液對(duì)固定化細(xì)胞強(qiáng)度的影響，最終得到4%CA－0.5%C－0.6%PEI－1%戊二醛固定化細(xì)胞機(jī)械強(qiáng)度好，通透性好，并且耐磷酸緩沖溶液，可以反復(fù)使用，此法固定化的細(xì)胞有望實(shí)現(xiàn)生物制藥的工業(yè)化。

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(責(zé)任編輯 呂志遠(yuǎn))

Abstract:The immobilization methods were studied in this paper.The immobilization methods were primarily screened by evaluating the mechanical intension and permeability of immobilized cell granules.The influence on buffer of immobilized cells was studied later and the optimum immobilized method was selected.The batch experiment results indicated that the immobilized cell granules obtained by active carbon－CA complex treated and intensified by 0.6%polyethylene imine and 1%Glutaraldehyde had the best mechanical intension，permeability and endurance on phosphate buffer solution.

Key words:Rhodotorula mucilaginosa;immobilized cell;mechanical intension;permeability

Study on the Immobilization Methods of Rhodotorula Mucilaginosa

YU Mei－yan
(College of Chemical and Food Engineering，Zhongzhou University，Zhengzhou 450044，China)

TQ92

A

1008－3715(2012)03－0123－03

2012－03－01

于梅艷(1980—)，女，河南周口人，碩士，中州大學(xué)化工食品學(xué)院助教，研究方向:固定化細(xì)胞技術(shù)及其應(yīng)用。