hfgl2凝血酶原酶基因5′端調(diào)控序列的克隆及生物信息學(xué)分析＊

李學(xué)軍，張 灝，李永敢，孫碧紅

（1.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院血液科，南寧530021；2.哈爾濱血液病腫瘤研究所血液科 150010）

人纖維蛋白原樣蛋白2（human fibrinogen－like protein 2，hfgl2）凝血酶原酶是新近發(fā)現(xiàn)的一種促凝因子，它可直接激活凝血酶原啟動(dòng)凝血過(guò)程，在功能上相當(dāng)于因子Ⅹa的作用。研究發(fā)現(xiàn)hfgl2凝血酶原酶與機(jī)體的一些病理過(guò)程有關(guān)，如習(xí)慣性流產(chǎn)、暴發(fā)性肝衰竭及移植排斥反應(yīng)等［1－4］。最近的研究表明，hfgl2凝血酶原酶的激活參與慢性阻塞性肺病的發(fā)生［5］。hfgl2凝血酶原酶可能參與記憶T細(xì)胞通過(guò)腸道的外滲或遷徙，并介導(dǎo)T細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，通過(guò)多種機(jī)制進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)［6－8］。因此，對(duì)hfgl2凝血酶原酶基因的深入研究，有助于進(jìn)一步了解相關(guān)疾病的病理生理機(jī)制?；虻漠惓Ｕ{(diào)控常常導(dǎo)致基因在疾病相關(guān)細(xì)胞中的表達(dá)異常，引起相應(yīng)的病理生理改變，目前對(duì)hfgl2凝血酶原酶基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究尚不深入。本研究采用生物信息學(xué)軟件初步預(yù)測(cè)了hfgl2凝血酶原酶基因近端啟動(dòng)子序列可能的轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點(diǎn)，并以螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒為載體構(gòu)建了相應(yīng)基因序列的報(bào)告基因質(zhì)粒，以進(jìn)一步研究hfgl2凝血酶原酶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與試劑 螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3－Basic、菌株E.coli DH5α、限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和HindⅢ購(gòu)自美國(guó)Promega公司；LA Taq酶及相關(guān)聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑、DNA提取試劑盒、DNA連接試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；DNA純化試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega公司。

1.2 序列分析與結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

1.2.1 hfgl2凝血酶原酶基因序列的獲得 以human fgl2為關(guān)鍵詞，搜索美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心核酸數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得hfgl2凝血酶原酶全長(zhǎng)mRNA序列。以hfgl2全長(zhǎng)mRNA序列進(jìn)行基本局部對(duì)比排列搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）分析，獲取人基因組與其同源的基因序列。取基因組序列中包括第一外顯子部分序列在內(nèi)的1 550bp（轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游1 464bp至下游86bp）的hfgl2凝血酶原酶基因5′端調(diào)控區(qū)序列進(jìn)行序列分析和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

1.2.2 hfgl2凝血酶原酶基因近端啟動(dòng)子序列的預(yù)測(cè) 登陸http：／／rulai.csh1.org／tool／FirstEF／及 http：／／www.fruitfly.org／seq＿tools／promoter.html，利用在線分析軟件對(duì)hfgl2凝血酶原酶基因5′端調(diào)控區(qū)序列中可能的啟動(dòng)子進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.3 胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸（cytosine guanine dinucleotides，CpG）島預(yù)測(cè) 登陸http：／／www.ebi.ac.uk／emboss／cpgplot／，利用在線分析軟件 EMBOSS（CpGPlot／CpGReport／Isochore）對(duì)hfgl2凝血酶原酶基因5′端調(diào)控區(qū)序列中可能的CpG島位置進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.4 hfgl2凝血酶原酶基因近端啟動(dòng)子序列順式作用元件的預(yù)測(cè) 登陸http：／／www.cbrc.jp／research／db／TFSEARCH.html，利用在線分析軟件TFSEARCH對(duì)hfgl2凝血酶原酶基因5′端側(cè)翼非翻譯區(qū)（5′untranslated regions，5－UTR）基因序列的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.3 hfgl2凝血酶原酶基因近端啟動(dòng)子序列質(zhì)粒的構(gòu)建

1.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)hfgl2凝血酶原酶基因－1 464～＋86區(qū)域的核苷酸序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增該序列的PCR引物。上游引物引入一KpnⅠ酶切位點(diǎn)：5′－GAG GGT ACC CAC GAG GTT CAA ACG TAC TG－3′，下 游 引 物 引 入 一HindⅢ酶切位點(diǎn)：5′－GCA AGC TTC TCT GTT TCA TTG TTT GCC A－3′。引物由TaKaRa公司合成。

1.3.2 質(zhì)粒的構(gòu)建 按常規(guī)方法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，應(yīng)用DNA提取試劑盒參照說(shuō)明提取細(xì)胞基因組DNA，以此DNA為模板，采用LATaq酶擴(kuò)增相應(yīng)DNA片段。PCR條件為：95℃預(yù)變性5min后加入0.5ULA Taq酶；94℃變性1min，60℃退火1.3min，72℃延伸2min，共30個(gè)循環(huán)，最后1個(gè)循環(huán)延伸5min。取5μL PCR產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠上電泳，觀察反應(yīng)結(jié)果。KpnⅠ和HindⅢ雙酶切PCR產(chǎn)物及載體pGI3－Basic，回收純化后，將PCR產(chǎn)物與載體大片段進(jìn)行連接反應(yīng)，將得到的質(zhì)粒命名為pGL3－h(huán)fgl2。所構(gòu)建質(zhì)粒采用KpnⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定，將含有酶切鑒定正確的E.coli DH5α送交TaKaRa公司測(cè)序。

2 結(jié) 果

2.1 hfgl2凝血酶原酶基因近端啟動(dòng)子序列的預(yù)測(cè) 經(jīng)過(guò)分析，hfgl2凝血酶原酶基因5′端調(diào)控區(qū)序列中可能存在2處啟動(dòng)子序列，結(jié)果見表1。

表1 hfgl2凝血酶原酶基因5′端調(diào)控區(qū)序列啟動(dòng)子序列及位置

2.2 hfgl2凝血酶原酶基因的CpG島預(yù)測(cè)結(jié)果 在線分析軟件EMBOSS（CpGPlot／CpGReport／Isochore）在hfgl2凝血酶原酶基因5′端調(diào)控區(qū)序列中未發(fā)現(xiàn)CpG島。

2.3 hfgl2凝血酶原酶基因近端啟動(dòng)子序列順式作用元件的預(yù)測(cè) 設(shè)定閾值大于90分，顯示在hfgl2凝血酶原酶基因－1 464～＋84區(qū)域共有138個(gè)、31種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，其中具有高閾值的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)包括加帽位點(diǎn)（CAP site）、熱休克轉(zhuǎn)錄因子（heat shock transcription factor，HSF）、尾側(cè)型同源轉(zhuǎn)錄因子A（caudal type homeobox transcription factor A，CdxA）、應(yīng)激反應(yīng)元件（stress response element，STRE）、Y染色體性別決定區(qū)（sex－determining region of Y－chromosome，SRY）、腈 水 解 酶 家 族 成 員 2（nitrilase family，member 2，NIT2）、deltaE、GATA－2、激活蛋白－1（activating protein－1，AP－1）、輔助轉(zhuǎn)錄因子p300以及乙醇脫氫酶基因調(diào)節(jié)因子 （alcohol dehydrogenase gene regulator 1，ADR1）。其中閾值為99分的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)見表2。

表2 閾值為99分的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)

圖1 hfgl2凝血酶原酶基因5′端調(diào)控區(qū)序列PCR擴(kuò)增電泳圖

圖2 hfgl2凝血酶原酶基因5′端調(diào)控區(qū)序列質(zhì)粒酶切圖

2.4 重組質(zhì)粒的克隆與鑒定 以HL－60細(xì)胞基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得長(zhǎng)度為1 567bp的hfgl2凝血酶原酶基因－1 464～＋84序列，與設(shè)計(jì)長(zhǎng)度一致，結(jié)果見圖1。將PCR擴(kuò)增基因片段插入pGL3－Basic載體得到重組質(zhì)粒pGL3－h(huán)fgl2，用KpnⅠ和HindⅢ雙酶切質(zhì)粒得到1 560bp大小的DNA片段，與設(shè)計(jì)的插入序列大小一致，結(jié)果見圖2。測(cè)序結(jié)果顯示各插入片段與GenBank公布的序列完全一致，見圖3。

圖3 重組質(zhì)粒pGL3－h(huán)fgl2的部分測(cè)序圖

3 討 論

基因表達(dá)是指基因在生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄、剪接、翻譯以及轉(zhuǎn)變成具有生物活性的蛋白質(zhì)分子之前的所有加工過(guò)程，轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)的第一步。轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，也稱為反式作用因子，有序地結(jié)合在特定基因5′端側(cè)翼調(diào)控序列特殊位點(diǎn)，啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄和控制基因的轉(zhuǎn)錄效率，這些位點(diǎn)即轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)或順式調(diào)控元件。每個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)都有特定的結(jié)合模式，找到這些特定的序列片段對(duì)研究基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有著重要意義［9］。

腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF－α）、干擾素α（interferonα，IFN－α）等輔助性 T 細(xì)胞（helper T cell，Th）1型細(xì)胞因子與小鼠及人類自發(fā)性流產(chǎn)密切相關(guān)，二者單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用都可誘發(fā)小鼠的流產(chǎn)，細(xì)胞因子通過(guò)觸發(fā)炎癥／血栓形成過(guò)程導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生，推測(cè)在人類自發(fā)性流產(chǎn)中也存在相同的機(jī)制［1，10－12］。在同種異體移植所引起的急性排斥反應(yīng)中，細(xì)胞因子通過(guò)激活fgl2凝血酶原酶而介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，使內(nèi)皮細(xì)胞損傷－凝血－炎癥反應(yīng)－內(nèi)皮損傷的惡性病理循環(huán)發(fā)生，導(dǎo)致移植排斥反應(yīng)［3］。這些細(xì)胞因子通過(guò)胞膜或細(xì)胞內(nèi)受體經(jīng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)轉(zhuǎn)換，改變靶基因的轉(zhuǎn)錄活性，誘發(fā)細(xì)胞特定的應(yīng)答反應(yīng)。而細(xì)胞內(nèi)受體分布于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)，本質(zhì)上都是配體調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子，均在細(xì)胞核內(nèi)啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并影響基因轉(zhuǎn)錄。

hfgl2凝血酶原酶基因定位在染色體7q11.23，全長(zhǎng)約7kb，有2個(gè)外顯子，中間有1個(gè)長(zhǎng)度約2.2kb的內(nèi)含子。hfgl2凝血酶原酶有2種mRNA轉(zhuǎn)錄本，長(zhǎng)度分別為4.4kb和1.5kb，其cDNA全長(zhǎng)為1 320bp，編碼的蛋白質(zhì)由439個(gè)氨基酸組成。通過(guò)對(duì)鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞fgl2凝血酶原酶啟動(dòng)子活性的研究顯示，fgl2凝血酶原酶的表達(dá)受其近側(cè)啟動(dòng)子序列中的順式元件調(diào)控，在多個(gè)反式因子的協(xié)同作用下，共同調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的基礎(chǔ)表達(dá)和對(duì)病毒誘導(dǎo)的反應(yīng)［13－14］，其基因5′端調(diào)控區(qū)存在的正性調(diào)控結(jié)構(gòu)域（positive regulatory domain，PRD）與轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)，PRD位于起始位點(diǎn)－87～－39位堿基，研究表明在PRD形成的核蛋白復(fù)合物包括特異蛋白（specificity protein，Sp）1／Sp3家族成員、八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子（octamerbinding transcription factor－1，Oct－1）和 E26轉(zhuǎn)錄因子－1（E26 transformation－specific－1，Ets－1）等［15］。本 研 究 顯 示，hfgl2 凝血酶原酶基因5′調(diào)控區(qū)序列中可能存在2處啟動(dòng)子序列，分別位于－670～－621和－72～－23位堿基。在hfgl2凝血酶原酶基因－1 464～＋84區(qū)域共有138個(gè)、31種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，究竟哪個(gè)啟動(dòng)子序列在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮主導(dǎo)作用以及轉(zhuǎn)錄因子對(duì)啟動(dòng)子有何影響尚有待進(jìn)一步研究。

CpG島是基因組中長(zhǎng)度為300～3 000bp的富含CpG二核苷酸的一些區(qū)域，主要位于基因的啟動(dòng)子和第一外顯子區(qū)域，常出現(xiàn)在真核生物看家基因（house－keeping gene）的調(diào)控區(qū)，約有60%以上基因的啟動(dòng)子含有CpG島。啟動(dòng)子區(qū)中CpG島的未甲基化狀態(tài)是基因轉(zhuǎn)錄所必需的，而CpG序列中胞嘧啶的甲基化可導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄被抑制。本研究通過(guò)在線軟件分析hfgl2凝血酶原酶基因5′端側(cè)翼調(diào)控序列，所分析的區(qū)域無(wú)CpG島存在，表明該基因的調(diào)控可能不受CpG島的甲基化影響［5］。

雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)是用以研究基因轉(zhuǎn)錄活性的，熒光素酶報(bào)告基因載體用螢火蟲熒光素酶基因作為報(bào)告基因，可對(duì)啟動(dòng)子及增強(qiáng)子序列作快速及方便的分析，熒光素酶報(bào)告基因載體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，可用熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)靈敏方便地測(cè)定熒光素酶基因的表達(dá)，pGL3載體含猴空泡病毒40（simian vacuolating virus 40，SV40）啟動(dòng)子及增強(qiáng)子的不同組合，有助于分析DNA片段的轉(zhuǎn)錄活性。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了hfgl2凝血酶原酶基因近端啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體，為研究該基因5′端側(cè)翼調(diào)控序列的各段DNA的調(diào)控活性奠定了基礎(chǔ)。

［1］ Yu G，Sun Y，F(xiàn)oerster K，et al.LPS－induced murine abortions require C5but not C3，and are prevented by upregulating expression of the CD200tolerance signaling molecule［J］.Am J Reprod Immunol，2008，60（2）：135－140.

［2］ Foerster K，Helmy A，Zhu Y，et al.The novel immunoregulatory molecule FGL2：apotential biomarker for severity of chronic hepatitis C virus infection［J］.J Hepatol，2010，53（4）：608－615.

［3］ Ning Q，Sun Y，Han M，et al.Role of fibrinogen－like protein 2prothrombinase／fibroleukin in experimental and human allograft rejection［J］.J Immunol，2005，174（11）：7403－7411.

［4］ Gao S，Wang M，Ye H，et al.Dual interference with novel genes mfgl2and mTNFR1ameliorates murine hepatitis virus type 3－induced fulminant hepatitis in BALB／cJ mice［J］.Hum Gene Ther，2010，21（8）：969－977.

［5］ Liu Y，Xu S，Xiao F，et al.The FGL2／fibroleukin prothrombinase is involved in alveolar macrophage activation in COPD through the MAPK pathway［J］.Biochem Biophys Res Commun，2010，396（2）：555－561.

［6］ Shalev I，Wong KM，F(xiàn)oerster K，et al.The novel CD4＋CD25＋regulatory T cell effector molecule fibrinogen－like protein 2contributes to the outcome of murine fulminant viral hepatitis［J］.Hepatology，2009，49（2）：387－397.

［7］ Liu H，Shalev I，Manuel J，et al.The FGL2－FcgammaRIIB pathway：a novel mechanism leading to immunosuppression［J］.Eur J Immunol，2008，38（11）：3114－3126.

［8］ Shalev I，Liu H，Koscik C，et al.Targeted deletion of fgl2 leads to impaired regulatory T cell activity and development of autoimmune glomerulonephritis［J］.J Immunol，2008，180（1）：249－260.

［9］ 許麗艷.轉(zhuǎn)錄調(diào)控的信息學(xué)分析［M］／／李霞.生物信息學(xué).北京：人民衛(wèi)生出版社，2010：296－316.

［10］Knackstedt MK，Zenclussen AC，Hertwig K，et al.Th1 cytokines and the prothrombinase fgl2in stress－triggered and inflammatory abortion［J］.Am J Reprod Immunol，2003，49（4）：210－220.

［11］Hancock WW，Szaba FM，Berggren KN，et al.Intact type 1immunity and immune－associated coagulative responses in mice lacking IFN gamma－inducible fibrinogen－like protein 2［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2004，101（9）：3005－3010.

［12］Su K，Chen F，Yan WM，et al.Fibrinogen－like protein 2／fib－roleukin prothrombinase contributes to tumor hypercoagulability via IL－2and IFN－gamma［J］.World J Gastroenterol，2008，14（39）：5980－5989.

［13］Yuwaraj S，Ding J，Liu M，et al.Genomic characterization，localization，and functional expression of FGL2，the human gene encoding fibroleukin：a novel human procoagulant［J］.Genomics，2001，71（3）：330－338.

［14］Han M，Yan W，Guo W，et al.Hepatitis B virus－induced hFGL2transcription is dependent on c－Ets－2and MAPK signal pathway［J］.J Biol Chem，2008，283 （47）：32715－32729.

［15］Ning Q，Lakatoo S，Liu M，et al.Induction of prothrombinase fgl2by the nucleocapsid protein of virulent mouse hepatitis virus is dependent on host hepatic nuclear factor－4alpha［J］.J Biol Chem，2003，278（18）：15541－15549.