不同膳食脂肪酸構(gòu)成對(duì)大鼠肝臟脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響＊

時(shí)皎皎，糜漫天，韋 娜，王 斌，易 龍，張乾勇△

（1.成都軍區(qū)總醫(yī)院營養(yǎng)科，成都 610083；2.第三軍醫(yī)大學(xué)營養(yǎng)與食品安全研究中心／重慶市營養(yǎng)與食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400038）

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活方式的改變，心血管疾?。╟ardiovascular disease，CVD）已成為危害人類健康的主要疾?。?］，而脂質(zhì)代謝紊亂引起的動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是CVD的重要誘因［2－3］。有研究發(fā)現(xiàn)，不同種類的膳食脂肪酸對(duì)血脂的變化存在不同程度的影響，而在相同膳食脂類攝入量下各種脂肪酸的構(gòu)成比不同也會(huì)對(duì)血脂調(diào)節(jié)以及CVD等慢性病的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生不同的效應(yīng)。本研究前期觀察到在總脂肪含量為15%（wt／wt）的膳食干預(yù)下，與對(duì)照組比較，飽和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）的攝入有顯著升高血脂的作用，單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA）和多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）則對(duì)血脂有顯著降低的作用，而1∶1n－6／n－3組的降血脂作用更加顯著且全面［4］。由于在機(jī)體脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)過程中，F(xiàn)AS、PPARα等在脂肪酸和膽固醇的合成與代謝、膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)、載脂蛋白水平等諸多方面都有重要的調(diào)控作用［5－6］。有研究也證明，不同種類的脂肪對(duì)這些脂代謝關(guān)鍵基因表達(dá)存在調(diào)節(jié)作用［7－8］?，F(xiàn)將本研究不同膳食脂肪酸對(duì)大鼠肝臟組織中脂質(zhì)代謝關(guān)鍵基因FAS、PPARα的mRNA表達(dá)的影響報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型與分組 選擇清潔級(jí)雌性Sprague－Dawley大鼠（45d齡）48只，體質(zhì)量140～170g（購自第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后，按照隨機(jī)分組設(shè)計(jì)方法分為6組各8只，即SFA組、MUFA組、n－6PUFA組、n－3PUFA組、1∶1n－6／n－3組和對(duì)照組。持續(xù)喂養(yǎng)18周。將大鼠置于（22±2）℃、50%濕度及正常晝夜節(jié)律的環(huán)境中分籠飼養(yǎng)，自由飲水。

1.2 試劑 n－6PUFA由四川嘉里糧油工業(yè)公司的“金龍魚”牌葵花籽油（主要含亞油酸）提供；n－3PUFA采用山東鴻祥神生物公司的魚油（主要含二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸）；MUFA由北京神州油橄欖技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)的特級(jí)初榨橄欖油（主要含油酸）提供；SFA由自煉豬油提供。上述油脂經(jīng)氣相色譜法分析其脂肪酸構(gòu)成。Trizol分離試劑購自Invitrogen公司，RNA酶抑制劑、dNTP、Olig－（dT）18購于上海生工生物工程技術(shù)有限公司，M－MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶購于Promega公司，溴化乙啶購于Sigma公司，PCR marker購于北京天為時(shí)代科技公司。

1.3 肝臟組織總RNA的提取 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，活殺大鼠，取肝臟組織0.1g，制備組織勻漿，利用Trizol試劑常規(guī)提取總RNA。每個(gè)樣品取1μL，ddH2O稀釋200倍后用核酸蛋白定量儀測定RNA含量與純度。整個(gè)過程所有使用的器械及液體均經(jīng)0.1%焦礦酸二乙酯（diethylpyrocarbonate，DEPC）水處理，戴消毒手套操作，防止RNA酶污染。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription，RT－PCR）檢測FAS和PPARαmRNA表達(dá)水平 取上述提取的總RNA 3 μg，65℃水浴5min和0℃冰浴5min后，依次加入RNA酶抑制劑20U、10mmol／L dNTP 2μL、Oligo（dT）18 1μg、5×反應(yīng)緩沖液4μL、M－MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶200U，加Erasol處理的去離子水至20μL，37℃孵育1h，再于70℃放置10min終止反應(yīng)。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1.5μL進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物序列根據(jù)基因率（Genebank）設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成，引物序列、退火溫度及產(chǎn)物長度見表1。擴(kuò)增的反應(yīng)參數(shù)為95℃預(yù)變性5min，94℃變性45s，60℃退火、45s，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)，72℃延長10min。反應(yīng)結(jié)束后，各取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，以含0.5μg／mL溴化乙啶的1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，Bio－Rad成像分析儀觀察并照像。PCR的特異條帶以相對(duì)吸光度（intensity）×面積（mm2）表示，用各組校正吸光度與β－actin校正吸光度的比值表示其表達(dá)強(qiáng)弱。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同膳食脂肪酸構(gòu)成對(duì)FAS基因表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，SFA組大鼠肝臟組織FAS mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.05），MUFA組、n－6PUFA組、n－3PUFA 組和1∶1n－6／n－3組大鼠肝臟組織FAS mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.05），見圖1～2。

圖1 不同脂肪酸構(gòu)成比喂飼對(duì)各組大鼠肝臟組織FAS mRNA表達(dá)的影響

2.2 不同膳食脂肪酸構(gòu)成對(duì)PPARα基因表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，SFA組和 MUFA組大鼠肝臟組織PPARαmRNA表達(dá)均無明顯變化（P＞0.05）。n－6PUFA組、n－3PUFA組和1∶1n－6／n－3組大鼠肝臟組織PPARαmRNA 表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。同時(shí)，與n－6PUFA組比較，n－3PUFA組和1∶1 n－6／n－3組大鼠肝臟組織 PPARαmRNA 表達(dá)顯著增加（P＜0.05），見圖3～4。

圖2 各組大鼠肝臟組織FAS mRNA表達(dá)電泳結(jié)果的灰度值分析

圖3 不同脂肪酸構(gòu)成比喂飼對(duì)各組大鼠肝臟組織PPARα mRNA表達(dá)的影響

圖4 各組大鼠肝臟組織PPARαmRNA表達(dá)電泳結(jié)果的灰度值分析

3 討 論

FAS是脂肪酸合成的限速酶，主要存在于肝臟、脂肪等組織中，在體內(nèi)起催化丙二酸單酰CoA連續(xù)結(jié)合成長鏈脂肪酸的反應(yīng)，其活性高低將直接控制著體內(nèi)脂肪合成的強(qiáng)弱，從而對(duì)機(jī)體的脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)起著重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，PUFA對(duì)FAS基因的表達(dá)具有較強(qiáng)的抑制作用。Clarke等［9］研究結(jié)果表明，n－6PUFA和n－3PUFA使肝臟中的FAS mRNA表達(dá)降低了75%～90%，而SFA和MUFA對(duì)FAS mRNA的表達(dá)則無顯著的抑制作用。此外，成廷水［10］研究發(fā)現(xiàn)，SFA對(duì)FAS酶的活性影響不大，而不飽和脂肪酸對(duì)動(dòng)物FAS的活性具有較明顯的抑制作用，這種抑制作用與不飽和脂肪酸的含量、不飽和程度、鏈的長短、雙鍵位置等多種因素有關(guān)。

本研究觀察到SFA組大鼠肝臟組織FAS mRNA的表達(dá)顯著升高（P＜0.05），而 MUFA 組、n－6PUFA 組、n－3PUFA組、1∶1n－6／n－3組大鼠肝臟組織的FAS mRNA 表達(dá)均顯著降低（P＜0.05）。這表明在同脂肪含量的情況下，n－3PUFA與n－6PUFA抑制FAS表達(dá)方面的功能要強(qiáng)于SFA和MUFA，與文獻(xiàn)［9］報(bào)道基本一致。本研究發(fā)現(xiàn)，SFA干預(yù)能導(dǎo)致大鼠肝臟組織FAS mRNA表達(dá)顯著升高，與韋娜和康漫天［11］研究結(jié)果一致。對(duì)于Clarke等［9］報(bào)道的SFA對(duì)FAS的表達(dá)沒有抑制作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異可能與本研究未對(duì)碳水化合物的攝入量做特別調(diào)整，同時(shí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)之間所選取的大鼠類型、干預(yù)飼料中的脂肪供能比、膳食干預(yù)時(shí)間以及脂肪酸的配比不一致等原因有關(guān)。

PPAR是核受體超家族成員中的一員，PPARα是肝臟中PPAR的主要形式，對(duì)體內(nèi)脂肪酸和膽固醇代謝、膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)以及血漿載脂蛋白水平均有調(diào)控作用，因此，在脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)過程中起著重要作用。PPARα能與視黃醇X受體α（retinoid X receptor alpha，RXRα）形成異源二聚體，識(shí)別靶基因上游的過氧化物酶體增殖劑反應(yīng)元件（peroxisome proliferator response element，PPRE），并啟動(dòng)靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而引起過氧化物酶體增殖以及脂肪酸途徑相關(guān)基因的活性和表達(dá)增強(qiáng)。有研究發(fā)現(xiàn)，PPARα激活后可促進(jìn)膽固醇向膽酸的轉(zhuǎn)化以降低血膽固醇水平，并可以通過調(diào)節(jié)脂蛋白代謝而改變血漿中脂肪酸和膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)水平。Clarke［12］研究發(fā)現(xiàn)，膳食SFA與MUFA干預(yù)對(duì)PPARα的表達(dá)無顯著影響，但PUFA尤其是n－3系的PUFA能有效升高PPARα的表達(dá)。進(jìn)一步研究表明，PUFA是PPARα的內(nèi)源性配體［13］，可有效激活PPARα并誘導(dǎo)PPARαmRNA的高表達(dá)［14］，從而促進(jìn)乳糜微粒、LDL－C和VLDL－C的代謝以及脂肪酸的β－氧化，并通過增加肝臟ApoA－I的表達(dá)來有效升高HDL－C的水平。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同種類及配比的膳食脂肪酸對(duì)大鼠肝臟組織PPARαmRNA表達(dá)的影響不同。與對(duì)照組比較，SFA組和MUFA組大鼠的PPARαmRNA表達(dá)無明顯變化（P＞0.05）；n－6PUFA組、n－3PUFA組和1∶1n－6／n－3組大鼠肝臟組織PPARαmRNA表達(dá)顯著增加（P＜0.05），說明n－6PUFA、n－3 PUFA膳食能明顯促進(jìn)PPARαmRNA的表達(dá)。同時(shí)，與n－6 PUFA組比較，n－3PUFA組和1∶1n－6／n－3組大鼠肝臟組織PPARαmRNA表達(dá)增加更顯著（P＜0.01）。因此，SFA和MUFA對(duì)PPARα的基因表達(dá)沒有顯著的調(diào)控作用，而PUFA作為PPARα的內(nèi)源性配體能夠有效增強(qiáng)PPARαmRNA的表達(dá)。在相同的總脂肪含量下，n－3PUFA 和1∶1n－6／n－3配比的膳食干預(yù)效果優(yōu)于n－6PUFA。這與以往的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。

綜上所述，SFA、MUFA主要是通過FAS途徑來調(diào)控機(jī)體的脂質(zhì)代謝，它們對(duì)PPARα的表達(dá)無明顯影響。與對(duì)照組比較，SFA能非常顯著地升高FAS mRNA的表達(dá)（P＜0.05），而MUFA能顯著降低FAS的基因表達(dá)（P＜0.05）。PUFA調(diào)節(jié)血脂的效應(yīng)更加全面，能夠顯著降低脂質(zhì)合成中的關(guān)鍵酶FAS的表達(dá)同時(shí)升高PPARα的表達(dá)。

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