耐培美曲塞人肺癌細(xì)胞系的建立

楊 民，王 峻，孟麗娟，劉福銀，樊衛(wèi)飛，蒲驍麟

0 引 言

肺癌是目前世界上常見的腫瘤相關(guān)性死亡原因，已居我國腫瘤發(fā)病及死亡原因首位［1］?，F(xiàn)階段不能手術(shù)的中晚期非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)仍采用以化療為主的綜合治療，但耐藥性的出現(xiàn)使得NSCLC的化療療效下降，故對于耐藥基因的研究日益受到重視。本實(shí)驗(yàn)通過體外誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞株A549對培美曲塞產(chǎn)生獲得性耐藥，建立A549培美曲塞耐藥株，為研究肺腺癌中培美曲塞的耐藥機(jī)制及耐藥相關(guān)基因的探討提供模型。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺腺癌細(xì)胞株A549購于美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心。培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM;培養(yǎng)條件:37℃，5%CO2、飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱;2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代。細(xì)胞培養(yǎng)所需培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶等均為Gibco公司產(chǎn)品;MTT為Sigma公司產(chǎn)品;培美曲塞為法國禮來公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 MTT法測 A549的 IC50 將細(xì)胞按5×103/孔接種于96孔板，24 h后加入10－2μg/L的培美曲塞，采用 MTT 法［2］分別于培養(yǎng) 24 h、32 h、40 h、48 h、56 h、64 h和72 h計(jì)算出其抑制率。將不同時(shí)間點(diǎn)測定的抑制率輸入SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包，最后得到不同時(shí)間點(diǎn)的抑制率變化情況，畫出變化的曲線，找出曲線平臺期(曲線變平坦)，該時(shí)間點(diǎn)作為最佳時(shí)間點(diǎn)。按上述相同的方法接種96孔板，24 h后加入不同濃度的培美曲塞(10－1～l0－8μg/L)，在最佳時(shí)間點(diǎn)處終止培養(yǎng)，按上述相同的方法在Dynateeh-MR7000儀上測定各孔570 nm波長處A值，再使用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包計(jì)算IC50，以所測得IC50濃度為中點(diǎn)，分別以5倍濃度梯度向兩側(cè)各延伸3個(gè)濃度梯度，以此濃度梯度為加藥濃度，共接種21個(gè)孔，每個(gè)濃度3孔，再以上述方法重新測出IC50。最后取3個(gè)平行孔的均值。

1.2.2 耐藥的誘導(dǎo) 以1/2 IC50濃度的培美曲塞誘導(dǎo)細(xì)胞60 h，轉(zhuǎn)化為完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔天換液，無菌PBS沖洗以去除死細(xì)胞，待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后，繼續(xù)加入1倍IC50濃度的培美曲塞誘導(dǎo)細(xì)胞60 h，隔天換液除去死細(xì)胞，待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后，再以上述方法重新測IC50，并重復(fù)上述步驟，直到IC50達(dá)到誘導(dǎo)耐藥前的5倍時(shí)，即視為獲得性耐藥誘導(dǎo)成功，收集細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，并計(jì)算耐藥指數(shù)RI(resistance index):

1.2.3 生長曲線和倍增時(shí)間測定 分別取對數(shù)生長期的正常A549和耐藥A549細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，以3×104/孔種植于24孔板，常規(guī)培養(yǎng)，分別于 24 h、48 h、72 h、96 h、120 h 進(jìn)行計(jì)數(shù)，每次取3孔計(jì)數(shù)，計(jì)算其平均值，繪制生長曲線。根據(jù)Patterson公式計(jì)算對數(shù)生長期的倍增時(shí)間:

1.2.4 克隆形成率檢測 取生長良好的正常A549和耐藥A549細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)，按每平皿400個(gè)細(xì)胞的濃度種植于直徑35 mm的平皿中，每組接種3個(gè)平皿，培養(yǎng)14 d后取出觀察，棄培養(yǎng)液，固定臺盼蘭染色，計(jì)數(shù)＞50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，計(jì)算克隆形成率，并計(jì)算其平均值:

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，2組均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，以P≤0.05為差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 培美曲塞作用A549的IC50測定 根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)藥物對細(xì)胞的抑制率曲線，計(jì)算出藥物與細(xì)胞的最佳作用時(shí)間約為48h。按上述方法將細(xì)胞按5×103/孔接種于96孔板，24 h后分別加入不同濃度(10－1～10－8μg/L)的培美曲塞，培養(yǎng) 48 h，計(jì)算各濃度的抑制率，計(jì)算其IC50為2.75×10－3μg/L。以2×10－3μg/L為基點(diǎn)，5倍濃度差分別向左右延伸，再次計(jì)算其IC50，并取3個(gè)平行孔的均值，得出A549對培美曲塞的 IC50 為(3.24±0.43) ×10－3μg/L。

2.2 耐藥的誘導(dǎo) 經(jīng)上述方法誘導(dǎo)耐藥約3個(gè)月，測得其 IC50為(4.8±0.87) ×10－2μg/L，耐藥指數(shù)為(14.81±1.47)。與A549細(xì)胞相比，差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。在普通培養(yǎng)液中傳代6周，其耐藥性穩(wěn)定，耐藥指數(shù)無明顯下降，認(rèn)為耐藥誘導(dǎo)成功。

2.3 A549/Pemetrexed生物學(xué)特性

2.3.1 藥敏試驗(yàn) MTT法檢測 A549/Pemetrexed對吉西他濱、紫杉醇、多西他賽、5氟脲嘧啶、順鉑、卡鉑的耐藥性，詳見表1。

表1 A549和A549/Pemetrexed的細(xì)胞藥敏結(jié)果Table 1 Drug sensitivity of A549 and A549/pemetrexed

2.3.2 生長曲線和倍增時(shí)間測定 圖 1顯示A549/Pemetrexed和A549細(xì)胞增殖速度接近，倍增時(shí)間分別為(63.03 ±0.98)h和(62.63 ±1.23)h(P＞0.05)，表明A549/Pemetrexed產(chǎn)生耐藥后其生長未受明顯影響。

圖1 A549/Pemetrexed和A549細(xì)胞的生長曲線Figure 1 Growth curves of A549 and A549/pemetrexed

2.3.3 克隆形成率檢測 圖2顯示在不同濃度的培美曲塞(10－6～1μg/L)中培養(yǎng)48h細(xì)胞克隆形成率，其中A549/Pemetrexed顯示出較高的耐藥性，克隆能力未受到太大影響。

圖2 A549/Pemetrexed和A549細(xì)胞的克隆形成率Figure 2 Cloning efficiency of A549 and A549/pemetrexed

3 討 論

培美曲塞是2004年美國食品與藥品管理局批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床的多靶葉酸拮抗劑，作用靶點(diǎn)包括嘧啶和嘌呤合成中的多種酶［3］，對晚期非小細(xì)胞肺癌有較好的療效［4］。Scagliotti等［5］應(yīng)用培美曲塞/順鉑和吉西他濱/順鉑方案治療1725例非小細(xì)胞肺癌，發(fā)現(xiàn)培美曲塞/順鉑與吉西他濱/順鉑方案的總生存率相似，但不良反應(yīng)更低。Gronberg等［6］報(bào)道培美曲塞/卡鉑聯(lián)合方案在體力狀況評分=2或年齡＞75歲老年人中取得較好的療效，且不良反應(yīng)可耐受。Peterson等［7］的研究則發(fā)現(xiàn)培美曲塞治療非鱗形細(xì)胞肺癌時(shí)較鱗形細(xì)胞肺癌有更好的療效。故目前培美曲塞可作為老年進(jìn)展期非鱗形NSCLC的一線治療方案。但隨著化療的進(jìn)程，其治療后耐藥性的產(chǎn)生影響了其最終療效［3］。因此，建立耐培美曲塞肺癌細(xì)胞模型對于闡明耐藥機(jī)制，提出預(yù)測療效、逆轉(zhuǎn)耐藥的有效策略具有較好的現(xiàn)實(shí)意義。

目前，腫瘤細(xì)胞耐藥細(xì)胞系的建立多采用藥物濃度遞增誘導(dǎo)法或高濃度間歇誘導(dǎo)法進(jìn)行誘導(dǎo)建株［8］。但2種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，前者劑量濃度較難把握，而后者歷時(shí)則較長。本研究將2種方法相結(jié)合，以培美曲塞對A549進(jìn)行誘導(dǎo)。經(jīng)反復(fù)作用，A549/Pemetrexed株的耐藥指數(shù)達(dá)(14.81±1.47)，并能穩(wěn)定生長傳代，同時(shí)對吉西他濱、5氟脲嘧啶、順鉑、卡鉑產(chǎn)生耐藥。A549/Pemetrexed與A549在生長曲線、倍增時(shí)間等方面相近，在克隆形成等方面存在差異。因此，本研究建立的A549/Pemetrexed細(xì)胞系可用于耐藥相關(guān)基因的檢測，為進(jìn)一步對培美曲塞耐藥機(jī)制及相關(guān)基因的研究提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

［1］肖鑫武，宋 勇，朱 虹，等.全身PET/CT在非小細(xì)胞肺癌預(yù)后判斷中的價(jià)值［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2010，23(12):1257-1260.

［2］禹立霞，謝 麗，魏 嘉，等.6種中藥提取物對胃癌細(xì)胞株細(xì)胞毒作用及多西紫杉醇增敏作用的研究［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2010，23(9):962-966.

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［5］Scagliotti G，Parikh P，von Pawel J，et al.PhaseⅢ study comparing cisplatin plus gemcitabine with cisplatin plus pemetrexed in chemotherapy-naive patients with advanced-stage NSCLC［J］.J Clin Oncol，2008，26(21):3485-3486.

［6］Gronberg BH，Bremnes R，Aasebo U，et al.Pemetrexed plus carboplatin versus gemcitabine plus carboplatin in the treatment of stage IIIB/IV NSCLC［J］.J Clin Oncol(Meeting Abstracts)，2007，25(Suppl 18):S7517.

［7］Peterson P，Park K，F(xiàn)ossella FV，et al.Is pemetrexed more effective in patients with non-squamous histology.A retrospective analysis of a phase III trial of pemetrexed vs docetaxel in previously treated patients with advanced NSCLC［J］.Eur J Cancer Suppl，2007，5(Suppl 4):S363.

［8］Davidson J D，Ma L，F(xiàn)lagella M，et al.An increase in the expression of ribonucleotide reductase large subunit 1 is associated with gemcitabine resistance in non-small cell lung cancer cell lines［J］.Cancer Res，2004，64(11):3761-3766.