寧夏部分地區(qū)奶牛乳腺炎病原菌的分離鑒定

王 東，李發(fā)萬，王旭青，王建波，蒲建明，丁林軍，劉軍紅，扈登強

（1.寧夏大學西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，寧夏銀川750021；2.銀川市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，寧夏銀川750001；3.寧夏大學外國語學院，寧夏銀川750021；4.銀川市農業(yè)局，寧夏銀川750001；5.吳忠市畜牧局，寧夏吳忠751100；6.寧夏博奧藥業(yè)有限公司，寧夏銀川750021）

奶牛乳腺炎是乳房受到物理、化學、微生物等因素的刺激所發(fā)生的一種炎性變化，其特點是乳房中體細胞增多以及乳腺組織發(fā)生病理變化［1］。奶牛乳腺炎不僅降低產奶量，影響牛奶的品質，造成奶產業(yè)的經濟損失，而且影響食品衛(wèi)生和人類健康，是目前危害奶牛業(yè)的主要疾病之一。引起奶牛乳腺炎的微生物種類繁多，如細菌、病毒、真菌、支原體等［2－3］，已報道從乳房炎的乳汁中分離130多種微生物，較常見的有20多種，其中以細菌較為常見，主要的致病菌是葡萄球菌、鏈球菌、大腸埃希菌，約占90%以上［4－5］，但不同地區(qū)奶牛乳房炎的細菌分布和種類有一定差異［6－8］。為了解寧夏地區(qū)奶牛乳腺炎的發(fā)病情況及病原菌的種類和分布狀況，進行了奶牛乳腺炎病原菌的分離和鑒定工作。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 奶樣 327份奶樣采自寧夏銀川市、吳忠市、石嘴山市、中衛(wèi)市4個市的9個縣（區(qū)）的16個規(guī)?；龅拿谌槠谀膛?。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、伊紅美藍瓊脂、三糖鐵瓊脂、高鹽甘露醇瓊脂、沙保羅液體培養(yǎng)基、沙保羅瓊脂等購自杭州天和微生物試劑有限公司；蛋白胨、酵母粉購自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；新生牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；蘭州隱性乳房炎診斷液購自中國農科院蘭州畜牧與獸藥研究所；葡萄球菌屬細菌生化鑒定管、鏈球菌細菌生化編碼鑒定管、腸桿菌科細菌生化常規(guī)鑒定管、酵母樣真菌生化鑒定管均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 隱性乳腺炎檢測 按常規(guī)方法清洗和消毒泌乳牛乳區(qū)，每個乳區(qū)取奶樣2 mL注入檢驗盤中，加入2 mL蘭州隱性乳房炎診斷液，作同心圓搖動，10 s后根據凝集反應程度進行判定?；旌弦壕鶆?，流動性好，無絮狀物（－）；有少許絮狀物或沉淀產生（弱陽性＋）；有明顯絮狀物或沉淀（陽性＋＋）；絮狀物或沉淀聚集成凝膠狀（強陽性＋＋＋）。檢測結果在兩個“＋”以上視為隱性乳腺炎病例［8－9］。

1.2.2 奶樣采集 奶樣來自于患乳腺炎的病牛（隱性乳腺炎檢測呈陽性或臨床型）。先用溫水清洗乳房，然后用1 mL／L新潔爾滅溶液擦洗，再用750 mL／L酒精棉球消毒乳頭。每個乳頭先棄去前3把奶，然后以無菌操作的方法從每個乳區(qū)分別采集5 mL～10 mL奶樣，置于經高壓滅菌的玻璃試管中，標明采樣牛場、牛號和日期，在冷藏條件下送實驗室做病原學檢查［6－7］。

1.2.3 病原菌分離培養(yǎng) 將試管中采集的奶樣搖勻后，接種血清肉湯培養(yǎng)基，37℃溫箱培養(yǎng)24 h～48 h；待培養(yǎng)基變混濁后分別接種營養(yǎng)瓊脂、綿羊鮮血瓊脂、高鹽甘露醇瓊脂、沙保羅瓊脂、麥康凱瓊脂、伊紅美藍瓊脂和三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基，37℃溫箱培養(yǎng)24 h～48 h，觀察菌落形態(tài)特征和溶血性，挑選單個菌落進行涂片、革蘭染色、鏡檢［6－8］。

1.2.4 病原菌鑒定

1.2.4.1 形態(tài)學鑒定 根據病原菌在各種培養(yǎng)基中的生長情況、菌落形態(tài)特征、溶血性及涂片鏡檢結果，將所分離的細菌初步分為葡萄球菌、鏈球菌、酵母菌、革蘭陽性桿菌、革蘭陰性桿菌［10－11］。

1.2.4.2 凝固酶試驗 挑取葡萄球菌菌苔，混懸于1∶4倍稀釋的兔血漿0.5 mL中，制成菌懸液，37℃培養(yǎng)2 h～4 h，凝固者為陽性［10］。

1.2.4.3 觸酶試驗 取1滴30 mL／L的過氧化氫，放在玻片上，然后挑取固體培養(yǎng)基上典型菌落，加到玻片上與試劑混合，如有大量氣泡者為陽性反應［10］。

1.2.4.4 CAMP試驗 取能產生β溶血的葡萄球菌液，沿平板中央畫直線接種綿羊鮮血瓊脂培養(yǎng)基，再取待檢鏈球菌菌液與葡萄球菌劃線垂直的方向劃直線接種，37℃培養(yǎng)24 h～48 h，能使綿羊紅血球呈箭頭狀溶血者為CAMP試驗陽性［10］。

1.2.4.5 生化鑒定 根據分離菌的培養(yǎng)特性、染色特點和形態(tài)特征，將初步篩選符合葡萄球菌、鏈球菌、腸桿菌、酵母樣真菌的培養(yǎng)物分別接種于葡萄球菌屬細菌生化鑒定管、鏈球菌細菌生化編碼鑒定管、腸桿菌科細菌生化常規(guī)鑒定管、酵母樣真菌生化鑒定管中，進行生化特性鑒定［10－11］。

2 結果

2.1 病原菌主要特性

2.1.1 金黃色葡萄球菌 在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上形成金黃色濕潤、光滑、隆起的中等大小菌落，有溶血現(xiàn)象；染色鏡檢形態(tài)一致，呈葡萄球狀，革蘭陽性；凝固酶試驗和觸酶試驗均為陽性。

2.1.2 凝固酶陰性葡萄球菌 在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上和鮮血瓊脂培養(yǎng)基生長良好；染色鏡檢形態(tài)一致，呈葡萄球狀，革蘭陽性；凝固酶試驗為陰性，觸酶試驗為陽性。

2.1.3 鏈球菌 在營養(yǎng)瓊脂平皿上生長不良，鮮血平皿上生長較好，菌落為露滴狀，圓形、隆起、半透明，呈α或β溶血；染色鏡檢形態(tài)一致，成雙或短鏈狀、長鏈狀排列；凝固酶試驗和觸酶試驗均為陰性。無乳鏈球菌不水解七葉苷和馬尿酸鈉，CAMP試驗陽性；停乳鏈球菌不水解七葉苷和馬尿酸鈉，CAMP試驗陰性；乳房鏈球菌水解七葉苷和馬尿酸鈉，CAMP試驗陰性。

2.1.4 大腸埃希菌 在營養(yǎng)瓊脂平皿和鮮血平皿上生長出灰色或灰白色大菌落；在伊紅美藍平皿上為黑色帶有金屬光澤菌落；在三糖鐵培養(yǎng)基上斜面和底部均為黃色；在麥康凱平皿上呈紅色菌落；染色鏡檢為短桿狀革蘭陰性菌。

2.1.5 芽胞桿菌 在營養(yǎng)平板和鮮血平板上為灰紅色或灰白色，鋸齒邊緣，紐扣狀、菜花狀，α或β溶血，革蘭染色為短桿狀，有明顯的芽孢。

2.1.6 酵母菌 在沙保羅瓊脂上為乳白色、圓形菌落，表面光滑。革蘭染色鏡檢，可見卵圓形或瓜子形的革蘭陽性菌。

2.2 乳樣細菌學檢出情況

采集寧夏4市9個縣（區(qū)）16個規(guī)?；龅?27份乳樣，接種細菌學培養(yǎng)基后，有226份乳樣分離出細菌，細菌檢出率69.11%。在檢出細菌的226份乳樣中，檢出1種細菌的乳樣192份，占84.96%（192／226）；檢出 2種以上細菌的乳樣 34 份，占15.04%（34／226）。

2.3 乳腺炎病原菌分離和鑒定

從檢出細菌的乳樣中，分離和鑒定出5大類細菌260株，其中葡萄球菌檢出率最高，占42.31%（110／260）；其次為鏈球菌，占21.54%（56／260）；革蘭陽性桿菌占17.31%（45／260）；革蘭陰性桿菌占15.77%（41／260）；酵母菌占3.08%（8／260）（表1）。

表1 奶牛乳腺炎主要病原菌分離和鑒定結果Table1 Results of isolation and identification of mastitis pathogens in dairy cows

從分離的5大類細菌中鑒定出9種主要病原菌，寧夏地區(qū)奶牛乳腺炎主要病原菌為凝固酶陰性葡萄球菌（28.08%），停乳鏈球菌（15.38%），金黃色葡萄球菌（14.23%），大腸埃希菌（10.38%）。奶牛乳腺炎主要病原菌分離和鑒定結果見表1。

2.4 臨床型乳腺炎病原菌分離結果

臨床型乳腺炎主要病原菌分離和鑒定結果見表2。從臨床型乳腺炎乳樣中，分離和鑒定各類細菌39株，其中主要病原菌為酵母菌（20.51%），凝固酶陰性葡萄球菌（17.95%），金黃色葡萄球菌（12.82%），停乳鏈球菌（12.82%），大腸埃希菌（12.82%）。

表2 奶牛臨床型乳腺炎主要病原菌分離和鑒定結果Table2 Results of isolation and identification of the clinical mastitis pathogens in dairy cows

2.5 隱性乳腺炎病原菌分離結果

隱性乳腺炎主要病原菌分離和鑒定結果見表3。從檢測的隱性乳腺炎乳樣中，分離和鑒定各類細菌221株，其主要病原菌為凝固酶陰性葡萄球菌（29.86%）、停乳鏈球菌（15.84%）、金黃色葡萄球菌（14.48%）和大腸埃希菌（9.95%）。

表3 奶牛隱性乳腺炎主要病原菌分離和鑒定結果Table3 Results of isolation and identification of the subclinical mastitis pathogens in dairy cows

3 討論

從寧夏9個縣（區(qū)）的16個規(guī)?；霾杉?27份乳腺炎奶牛乳樣，通過分離培養(yǎng)和生化試驗，檢出含細菌乳樣226份，乳樣細菌檢出率69.11%（226／327）；鑒定奶牛乳腺炎病原菌5大類9種260株，確認寧夏地區(qū)奶牛乳腺炎主要病原菌為凝固酶陰性葡萄球菌，停乳鏈球菌，金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌。本研究初步查明寧夏地區(qū)奶牛乳腺炎病原菌的種類和分布狀況，為寧夏地區(qū)奶牛乳房炎的防治工作提供科學依據。

本研究從寧夏奶牛主要養(yǎng)殖地區(qū)采集327份患乳腺炎的病牛乳樣，檢出含細菌乳樣226份，細菌檢出率 69.11%（226／327），低于李桐［6］細菌分離率94.81%和宋華容細菌分離率90%的報道。在檢出細菌的226份［8］乳樣中，單一細菌感染乳樣占84.96%（192／226），混合感染乳樣占15.04%（34／226），說明由單一病原菌引起的乳腺炎較為普遍，而混合感染僅占較少比例。這與尹柏雙［7］和梁建光等［12］的報道相似。

奶牛乳腺炎是由病原微生物侵入乳腺組織所產生的一種炎癥反應，盡管引起奶牛乳腺炎的病原微生物種類繁多，但是據文獻報道，奶牛乳腺炎的病原微生物主要以金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸埃希菌為主，約占90%以上［4－5］。本試驗從患乳腺炎病牛乳樣中分離和鑒定出5大類細菌260株，其中葡萄球菌檢出率最高，占42.31%（110／260）；其次為鏈球 菌，占 21.54% （56／260）；革 蘭 陽 性 桿 菌 占17.31%（45／260）；革蘭陰性桿菌占15.77%（41／260）；酵母菌占3.08%（8／260）。從分離的5大類細菌中鑒定出9種主要病原菌，分別為金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌、大腸埃希菌、其他革蘭陰性桿菌、芽胞桿菌和酵母菌，其中凝固酶陰性葡萄球菌占28.08%，停乳鏈球菌占15.38%，金黃色葡萄球菌占14.23%，大腸埃希菌占10.38%，這4種細菌占分離菌總數(shù)的68.08%（177／260），是寧夏地區(qū)奶牛乳腺炎的主要病原菌。

奶牛乳腺炎包括臨床型乳腺炎和隱性乳腺炎。本試驗對寧夏地區(qū)臨床型乳腺炎和隱性乳腺炎的病牛乳樣進行病原菌分離和鑒定，兩種類型乳腺炎的病原菌種類和細菌分布有一定差異。臨床型乳腺炎的主要病原菌為酵母菌（20.51%），凝固酶陰性葡萄球菌（17.95%），金黃色葡萄球菌（12.82%），停乳鏈球菌（12.82%），大腸埃希菌（12.82%）；隱性乳腺炎的主要病原菌為凝固酶陰性葡萄球菌（29.86%），停乳鏈球菌（15.84%），金黃色葡萄球菌（14.48%），大腸埃希菌（9.95%）。兩種類型乳腺炎病原學檢查結果的顯著特點之一為從臨床型乳腺炎病例中分離到酵母菌，并且所占比例最高，這與高玉君等［13］和韓春楊等［14］報道相似。追蹤檢出酵母菌病牛的流行病學資料后發(fā)現(xiàn)，這些病牛普遍病程較長，經過多次抗生素和中藥治療，治療效果不顯著，因此，酵母菌可能通過污染的灌注導管、注射器、針頭等途徑，跟隨多次乳房藥物灌注醫(yī)源性進入乳房。由于酵母菌對一般抗生素不敏感，對于該病的治療，應通過藥敏試驗，篩選高效、敏感的抗真菌藥物，應用于臨床治療，才能取得預期治療效果。

從臨床型乳腺炎和隱性乳腺炎病牛乳樣中同時分離到凝固酶陰性葡萄球菌，是本次乳腺炎病原學檢測結果的另一個顯著特點。凝固酶陰性葡萄球菌在隱性乳腺炎各類病原菌中所占比例最高（29.86%），明顯高于停乳鏈球菌（15.84%），金黃色葡萄球菌（14.48%），大腸埃希菌（9.95%）；在臨床型乳腺炎中，凝固酶陰性葡萄球菌（17.95%）所占比例僅低于酵母菌（20.51%），但高于金黃色葡萄球菌（12.82%），停乳鏈球菌 （12.82%），大腸埃希菌（12.82%），說明凝固酶陰性葡萄球菌是引起寧夏地區(qū)奶牛乳腺炎的主要病原菌，應該給予足夠的關注。這一試驗結果與馬保臣［15］和何挺等［16］的報道相似。

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